黃酮類化合物廣泛分布于自然界,許多蔬菜、水果和藥用植物中都含有此類成分,如黃芩、槐花、沙棘、甘草等中藥中就含有多種黃酮類成分,有些是其主要活性成分.黃酮類化合物不僅分布廣泛而且具有多樣的生物活性,其中抗腫瘤的活性最為引人注目,抗菌活性已經得到了醫學界的廣泛認可.

文獻中報道了許多具有較好抗菌活性的天然黃酮類化合物.然而很多黃酮類化合物溶解性能較差、生物利用度不高、生物活性不夠強,這限制了其臨床應用和新藥開發.如果以黃酮類化合物作為先導,對其進行結構修飾,研究結構與其活性之間的關系.

通過活性優化就有可能發現活性更好、具有藥用開發前景的化合物.因此,設計和合成結構多樣性黃酮類化合物庫就顯得非常必要.

我們以2-羥基苯乙酮和2,6-二羥基苯乙酮為原料,在對改進的Baker-Venkataraman重排反應進行系統研究的基礎上,得到了系列黃酮類和它的中間體-丙二酮類化合物,合成路線見圖1.

因此,有必要對所合成的黃酮類化合物及中間體進行抗腫瘤篩選,以期發現高效、低毒、選擇性好的化合物,并分析其抗腫瘤活性和結構之間的關系,為進一步化學修飾和作用機制研究奠定基礎.

1、實驗部分

1.1儀器與試劑

實驗的主要儀器有R206D旋轉蒸發儀,XT5A型顯微熔點測定儀\\(溫度計未校訂\\),RET控制型加熱磁力攪拌器,美國HPI100質譜聯用儀,美國VARIAN INOVA\\(400MHZ\\)超導核磁共振儀以及APEX-2高分辨質譜儀.

人宮頸癌細胞株\\(Hela\\)引自北京師范大學生命科學院.所有試劑均為分析純,其中丙酮經干燥處理.

1.2合成\\(1\\)1-\\(2-羥基苯基\\)-3-苯基-1,3-丙二酮及其衍生物的合成在反應瓶中加入2-羥基苯乙酮162mol,無 水K2CO31.62 mmol及干燥丙酮60mL,60℃油浴回流攪拌下滴加苯甲酰氯及其衍生物486mmol.滴畢,加熱回流反應24h,TLC檢測反應完畢.將反應液冷卻至室溫,過濾,用少量丙酮淋洗濾餅.

然后，加入10%乙酸\\(100mL\\)中,充分攪拌,待停止冒氣泡后過濾.濾餅用水洗滌至中性,真空干燥后用丙酮重結晶得黃色針狀晶體\\(3a~3e\\).1-\\(2-羥基苯基\\)-3-苯基-1,3-丙二酮\\(3a\\):淡黃色針狀結晶,收率80.3%,熔點:117 ~121 ℃;1H NMR\\(400MHz,CDCl3\\)δ:7.94\\(d,J=9.8Hz,2H,2′,6′-H\\),7.79\\(dd,J=9.4,4.7Hz,1H,6-H\\),7.18-7.56\\(m,4H,3′,4′,5′-H,7-H\\),7.01\\(dd,J=12.7,6.3 Hz,1H,3-H\\),6.95\\(m,1H,5-H\\),6.85\\(s,1H\\).1-\\(2-羥基苯基\\)\\(4′-氟苯基\\)-1,3-丙二酮\\(3b\\):淡黃色針狀結晶,收率71.8%,熔點:135~136℃;1H NMR\\(400MHz,CDCl3\\)δ7.96\\(dd,J=8.7,5.4 Hz,2H,2′,6′-H\\),7.78\\(d,J=8.0 Hz,1H,6-H\\),7.54-7.42\\(m,1H,4-H\\),7.18\\(t,J=8.5Hz,2H,3′,4′-H\\),7.01\\(d,J=8.4 Hz,1H,3-H\\),6.93\\(t,J=7.6Hz,1H,5-H\\),6.79\\(s,1H\\).

1-\\(2-羥基苯基\\)-3-\\(4′-氯苯基\\)-1,3-丙 二 酮\\(3c\\):淡黃色針狀結晶,收率85.7%,熔點:125 ~127℃;1H NMR\\(400 MHz,CDCl3\\)δ7.89\\(d,J=8.5Hz,2H,2′,6′-H\\),7.78\\(d,J=8.0 Hz,1H,6-H\\),7.48\\(t,J=8.1Hz,3H,3′,4′,4-H\\),7.02\\(d,J=8.4 Hz,1H,3-H\\),6.94\\(t,J=7.6 Hz,1H,5-H\\),6.82\\(s,1H\\).

1-\\(2-羥基苯基\\)-3-\\(4′-甲基苯基\\)-1,3-丙二酮\\(3d\\):淡黃色針狀結晶,收率73.5%,熔點:111 ~114℃;1H NMR\\(400 MHz,CDCl3\\)δ7.85\\(d,J=8.2 Hz,2H,2′,6′-H\\),7.81-7.74\\(m,1H,6-H\\),7.51-7.42\\(m,1H,5-H\\),7.29\\(t,J=7.3Hz,2H,3′,4′-H\\),7.00\\(d,J=8.2Hz,1H,3-H\\),6.92\\(t,J=7.6Hz,1H,4-H\\),6.82\\(s,1H\\),2.44\\(s,1H,-CH3\\).

1-\\(2-羥基苯基\\)-3-\\(4′-甲氧基苯基\\)-1,3-丙二酮\\(3e\\):淡黃色針狀結晶,收率70.9%,熔點:107~111℃;1H NMR\\(400 MHz,CDCl3\\)δ7.93\\(d,J=8.7Hz,2H,2′,6′-H\\),7.78\\(t,J=6.5 Hz,1H,6-H\\),7.46\\(dd,J=15.6,8.1Hz,1H,5-H\\),7.03-6.88\\(m,4H,3′,4′,3,4-H\\),6.78\\(s,1H\\),3.89\\(3H,-OCH3\\).

\\(2\\)黃酮母核及其衍生物的合成在裝有回流冷凝器、磁子、溫度計的三頸瓶中加入1-\\(2-羥基苯基\\)-3-苯基-1,3-丙二酮及其衍生物50mmol,然后加入20mL冰醋酸和0.16mL濃硫酸,控制反應溫度為95~100 ℃加熱回流反應3h.TLC檢測反應完畢,冷卻至室溫.

減壓蒸餾大約15mL的冰醋酸,將剩余物倒入100mL冷水中.有白色乳狀沉淀生成,靜置,使沉淀析出完全,過濾,濾餅用水洗滌至中性.真空干燥后用無水乙醇重結晶得到白色針狀晶體\\(4a~4e\\).

黃酮母核\\(4a\\):白色針狀結晶,收率75.3%,熔點:96~99 ℃;1H NMR\\(400 MHz,CDCl3\\)δ8.25\\(d,J=8.0Hz,1H,5-H\\),8.02-7.89\\(m,2H,2H,2′,6′-H\\),7.73\\(t,J=7.7Hz,1H,7-H\\),7.65-7.49\\(m,4H,3′,4′,5′,8-H\\),7.45\\(t,J=7.5Hz,1H,6-H\\),6.90\\(s,1H,3-H\\);ESI-MS\\(positive\\):calcd forC15H10O2\\([M+Na]+\\)245.24;found 245.08\\(M+Na\\)+.

4′-氟黃酮\\(4b\\):灰白色針狀結晶,收率60.1%,熔點:152~155 ℃;1H NMR\\(400 MHz,CDCl3\\)δ8.24\\(d,J=7.8Hz,1H,5-H\\),8.03-7.89\\(m,2H,2′,6′-H\\),7.73\\(t,J=7.7Hz,1H,7-H\\),7.62-7.52\\(m,1H,8-H\\),7.45\\(t,J=7.5Hz,1H,6-H\\),7.23\\(d,J=8.3 Hz,2H,3′,4′-H\\),6.83\\(s,1H,3-H\\);ESI-MS\\(positive\\):calcd for C15H9O2F\\([M+H]+\\)241.18;found 241.00\\(M+H\\)+.

4′-氯黃酮\\(4c\\):白色針狀結晶,收率57.8%,熔點:191~194 ℃;1H NMR\\(400 MHz,CDCl3\\)δ8.24\\(d,J=7.9Hz,1H,5-H\\),7.89\\(d,J=8.5Hz,2H,2′,6′-H\\),7.73\\(t,J=7.8Hz,1H,7-H\\),7.58\\(d,J=8.4Hz,1H,8-H\\),7.52\\(d,J=8.5Hz,2H,3′,4′-H\\),7.45\\(t,J=7.5 Hz,1H,6-H\\),6.83\\(s,1H,3-H\\);ESI-MS\\(positive\\):

calcd for C15H9O2Cl\\([M+H]+\\)257.63;found 257.44\\(M+H\\)+.

4′-甲基黃酮\\(4d\\):白色針狀結晶,收率51.6%,熔點:115~117 ℃;1H NMR\\(400 MHz,CDCl3\\)δ8.24\\(d,J=7.9Hz,1H,5-H\\),7.85\\(d,J=8.0Hz,2H,2′,6′-H\\),7.72\\(t,J=7.7Hz,1H,7-H\\),7.59\\(d,J=8.4Hz,1H,8-H\\),7.44\\(t,J=7.5Hz,1H,6-H\\),7.34\\(d,J=8.0Hz,2H,3′,4′-H\\),6.87\\(s,1H,3-H\\),2.45\\(s,3H,CH3\\);ESI-MS\\(positive\\):

calcd for C16H12O2\\([M+ H]+\\)237.22;found237.00.

4′-甲氧基黃酮 \\(4e\\):白色針狀結晶,收率61.6%,熔點:161~163 ℃;1H NMR\\(400 MHz,CDCl3\\)δ8.24\\(dd,J=7.9,1.5 Hz,1H,5-H\\),7.98-7.86\\(m,2H,2′,6′-H\\),7.70\\(ddd,J=8.6,7.2,1.7 Hz,1H,7-H\\),7.57\\(d,J=8.3 Hz,1H,8-H\\),7.43\\(dd,J=11.1,4.0 Hz,1H,6-H\\),7.04\\(d,J=8.9 Hz,2H,3′,4′-H\\),6.79\\(s,1H,3-H\\),3.90\\(s,3H,OCH3\\);ESI-MS\\(positive\\):calcd forC16H12O3\\([M+ H]+\\)253.28;found 253.08\\(M+H\\)+.

\\(3\\)5-羥基黃酮及其衍生物的合成在反應瓶中加入2,6-二羥基苯乙酮0.01mmol,無水K2CO30.08mmol及干燥丙酮60mL,60℃油浴回流攪拌下滴加苯甲酰氯及其衍生物2a~2d0.03mmol.

滴畢,反應24h,TLC檢測反應完畢.

將反應液冷卻至室溫,過濾,用少量丙酮洗滌濾餅.

然后轉入10%乙酸\\(100mL\\)中,充分攪拌,待停止冒氣泡后,過濾,濾餅用水洗滌至中性.

真空干燥后用硅膠柱色譜分離得到5-羥基黃酮及其衍生物6a~6d和3-苯甲?；?5-羥基黃酮及其衍生物7a~7d,6a和7a的展開劑為石油醚∶乙酸乙酯=12∶1;6b和7b的展開劑為石油醚∶乙酸乙酯=8∶1;6c和7c的展開劑為石油醚∶乙酸乙酯=10∶1;7d的展開劑為石油醚∶乙酸乙酯=15∶

1.產物的表征數據如下:5-羥基黃酮\\(6a\\):淡黃色結晶,收率41.6%,熔點:160~162 ℃;1H NMR\\(400 MHz,CDCl3\\)δ7.93\\(dd,J=8.0,1.6Hz,2H,2′,6′-H\\),7.63-7.47\\(m,4H,3′,4′,5′,7-H\\),7.02\\(d,J=8.4 Hz,1H,8-H\\),6.83\\(d,J=8.2Hz,1H,6-H\\),6.75\\(s,1H,3-H\\);ESI-MS\\(positive\\):calcd for C1 5H1 0O3\\([M+H]+\\)239.24;found 239.05\\(M+H\\)+.

3-苯甲?；?5-羥基黃酮\\(7a\\):淡黃色棒狀結晶,收率45.7%,熔點:178~180 ℃;1H NMR\\(400MHz,CDCl3\\)δ12.17\\(s,1H,OH\\),7.93\\(d,J=7.9Hz,2H,2H,2′,6′-H\\),7.59\\(m,4H\\),7.48-7.32\\(m,5H\\),7.02\\(t,J=10.6 Hz,1H,8-H\\),6.86\\(t,J=8.2Hz,1H,6-H\\);ESI-MS\\(positive\\):calcd forC22H1 4O4\\([M+ H]+\\)343.34;found 343.15\\(M+H\\)+.

4′-氟-5-羥基黃酮 \\(6b\\):淡黃色結晶,收率39.0%,熔點:162~163 ℃;1H NMR\\(400 MHz,CDCl3\\)δ12.54\\(s,1H,OH\\),7.93\\(dd,J=8.0,5.4Hz,2H,2′,6′-H\\),7.55\\(q,J=8.5 Hz,1H,7-H\\),7.23\\(d,J=8.3Hz,2H,3′,4′-H\\),7.00\\(d,J=8.4Hz,1H,8-H\\),6.83\\(d,J=8.2 Hz,1H,6-H\\),6.69\\(s,1H,3-H\\);ESI-MS\\(positive\\):calcdfor C1 5H9O3F\\([M+H]+\\)257.23;found 257.04\\(M+H\\)+.

3-\\(4′′-氟-苯甲?；鵟\)-4′-氟-5-羥基黃酮\\(7b\\):淡黃色結晶,收率44.9%,熔點:133~136 ℃,該化合物為首次報道;1H NMR\\(400MHz,CDCl3\\)δ12.09\\(s,1H,OH\\),8.00-7.90\\(m,2H,2′,6′-H\\),7.64\\(m,3H,Ar-H\\),7.13-7.01\\(m,5H,Ar-H\\),6.88\\(d,J=8.3Hz,1H,6-H\\).

IR\\(KBr\\),v/cm-1:2 926.76,1 663.62,1 693.04,1 468.73,1 415.99,1 224.22,1 159.79,814.06,729.30,604.61;HRMS\\(ESI,positive\\):calcd forC22H12O4F2\\([M+ H]+\\)379.077 6;found379.076 8.

4′-氯-5-羥基黃酮\\(6c\\):淡黃色針狀結晶,收率49.7%,熔點:192~194 ℃;1H NMR\\(400 MHz,CDCl3\\)δ12.51\\(s,1H\\),7.87\\(d,J=8.6 Hz,2H,2′,6′-H\\),7.62-7.47\\(m,3H,3′,5′,7-H\\),7.01\\(d,J=8.4Hz,1H,8-H\\),6.84\\(d,J=8.3Hz,1H,6-H\\),6.72\\(s,1H,3-H\\);ESI-MS\\(positive\\):calcd forC1 5H9O3Cl\\([M+ H]+\\)273.69;found 273.49\\(M+H\\)+.

3-\\(4′′-氯-苯甲?；鵟\)-4′-氯-5-羥基黃酮\\(7c\\):淡黃色無定形粉末,收率30.1%,該化合物熔點和1H NMR數據沒有文獻報道,1H NMR\\(400 MHz,CDCl3\\)δ12.05\\(s,1H\\),7.86\\(d,J=8.2 Hz,2H,2′,6′-H\\),7.64\\(t,J=8.4Hz,1H,7-H\\),7.57\\(d,J=8.2Hz,2H\\),7.43\\(d,J=8.3 Hz,2H\\),7.37\\(d,J=8.3 Hz,2H\\),7.03\\(d,J=8.4 Hz,1H,8-H\\),6.89\\(d,J=8.4 Hz,1H,6-H\\)\\);ESI-MS\\(positive\\):calcd for C22H12O4Cl2\\([M+ H]+\\)412.23;found 412.05.

3-\\(4′′-甲基-苯甲?；鵟\)-4′-甲 基-5-羥基黃酮\\(7d\\):淡黃色針狀結晶,收率76.4 %,熔點:

230~234℃,該化合物熔點和1H NMR數據沒有文獻報道;1H NMR\\(400 MHz,CDCl3\\)δ12.23\\(s,1H\\),7.84\\(d,J=8.1Hz,2H,2′,6′-H\\),7.65-7.52\\(m,3H,Ar-H\\),7.24\\(d,J=8.0Hz,2H,Ar-H\\),7.17\\(d,J=8.1Hz,2H,Ar-H\\),7.02\\(d,J=8.4Hz,1H,8-H\\),6.85\\(d,J=8.3Hz,1H,6-H\\),2.39\\(s,3H,-CH3\\),2.34\\(s,3H,-CH3\\);ESI-MS\\(positive\\):calcd for C2 4H1 8O4\\([M+ H]+\\)372.40;found372.25.

1.3體外抑制腫瘤細胞增殖活性

按照文獻[8]方法,取對數生長期的Hela細胞,細胞密度為5×104個/mL,接種于96孔培養板中.

每孔RPMI-1640培養基200μL,置于37 ℃、5%的CO2及90%濕度條件下無血清孵育48h.

細胞完全貼壁后,更換新鮮培養液.

設空白對照組\\(普通培養基\\)、實驗組 \\(10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL藥物濃度梯度\\),每個處理組設3個平行孔,加在96孔板內.

每孔加20μL,加藥完畢后放回孵箱繼續培養48h后,吸棄上清液,每孔加入新鮮配制的MTT溶液\\(5mg/mL\\)20μL,在37 ℃恒溫培養箱中繼續培養4h.

終止培養,棄除孔內上清液,每孔加 入DMSO 200μL,平板搖床振蕩30 min\\(60次/min\\)使甲臜沉淀充分溶解.

用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定各孔的吸光度\\(A值\\),重復測試3次,取平均值為最終結果.

經培養的癌細胞通過孔中藥物抑制后,按細胞抑制率=\\(對照組A值-實驗組A值/對照組A值\\)×100%計算細胞抑制率.

抑制率為正值表示藥物對腫瘤細胞的生長具有抑制作用,負值表示藥物對腫瘤細胞的生長具有促進作用.

通過回歸計算,求出半數抑制濃度,即細胞增殖抑制率為50%時的藥物濃度\\(IC50值\\).

目標化合物對HeLa細胞的抗腫瘤增殖活性見表1.

從表1可 知,-丙二酮類化合物在濃度<100μg/mL時,對HeLa細胞不但沒有抑制活性,相反都表現出促進增殖作用.

而關環后生成的黃酮類化合物在低濃度下\\(10μg/mL\\)對HeLa細胞沒有抑制活性,但在較高濃度時表現出一定的抑制作用.

這種作用成劑量依賴性關系,這也從側面證明黃酮類化合物潛在的抗腫瘤活性.

實驗結果發現,目標化合物7b對HeLa細胞表現出較強的抗增殖活性,IC50值為95.5μM,值得進一步研究.

從表1也可以看出,在黃酮母核、5-羥基黃酮的4′-位分別引入F、Cl、OCH3、CH3所形成的化合物中,4′-氟黃酮、4′-氟-5-羥基黃酮對HeLa細胞的抑制作用明顯強于其他三種基團取代的化合物.

而含F化合物7b具有較強的抗腫瘤活性,這可能是由于氟原子的強吸電子作用使化合物的極性增大,從而使化合物的溶解性能增強所致.

因此在后續的黃酮類化合物結構修飾時,可以考慮在其4′-位引入氟原子來增強它們的抗腫瘤活性.

2、結論

近年來,我們一直致力于黃酮類化合物的結構改造和生物活性研究,該研究通過用不同的原料對改進的Baker-Venkataraman重排反應進行了系統研究.

結果發現,當2-羥基苯乙酮的6-位沒有羥基時,例如2-羥基苯乙酮、2,4-二羥基苯乙酮、2,5-二羥基苯乙酮、3-甲基-2,5-二羥基苯乙酮等和苯甲酰氯及其衍生物在碳酸鉀的丙酮溶液中發生Baker-Venkataraman重排反應,其酯化、重排一步完成首先得到-丙二酮類化合物,將-丙二酮關環就可得到黃酮類化合物;當2-羥基苯乙酮的6-位有羥基時,例如2,6-二羥基苯乙酮及2,4,6-三羥基苯乙酮,它們與苯甲酰氯及其衍生物在碳酸鉀的丙酮溶液中也可發生Baker-Venkataraman重排反應,并且酯化、重排、關環一步完成,直接得到5-羥基黃酮、3-苯甲?；?5-羥基黃酮及其衍生物和3-苯甲?；?5,7-二羥基黃酮等.

從目標化合物的體外抗腫瘤活性測試結果可以看出,在黃酮母核的4′-位引入F有利于增強黃酮類化合物的抗腫瘤活性,優選出的化合物7b具有潛在的抗腫瘤增殖活性,具有深入研究的價值.