糖尿病是因自身免疫失調、基因或代謝異常而引起胰島素缺乏和/或糖異生增加、血糖升高的一類內分泌疾病。國際糖尿病基金會的研究表明全球1 型和 2 型糖尿病的患病率為 8.3%。1 型和多數 2型糖尿病患者由于胰島 β 細胞損傷或功能失調均需給予胰島素治療。重組人胰島素是以重組 DNA技術合成的一種多肽類激素，其分子結構中包含 51個氨基酸殘基，與人胰島 β 細胞生成的天然人胰島素結構相同。為實現特定的藥動學和藥效學特征，滿足不同患者的治療和應用需求，各種重組胰島素制劑和重組胰島素類似物不斷涌現。重組人胰島素注射液 Insulin R 和 Humulin R 均通過 Escherichacoli 菌株生產而得，制劑中未加入其他改變藥物吸收速率和作用時間的物質。通過以美國 Lilly 公司的 Humulin R 為對照品，評價國產重組人胰島素注射液Insulin R供試品在正常Beagle犬體內的相對生物利用度，并對兩者進行生物等效性評價。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 受試藥物 重組人胰島素注射液（InsulinR），規格 3 mL∶300 U，批號 20111202，合肥天麥生物科技發展有限公司提供。重組人胰島素注射液（優泌林 R，Humulin R），規格 3 mL∶300 U（筆芯），1 支/盒，批號 A850900C，分包裝批號 L02227，法國禮來公司生產。

1.1.2 試劑 抑肽酶，比活＞5 500 U/mg，規格 5mg/ 瓶，美國羅氏公司產品（進口分裝），批號6247884，2～8 ℃保存。

1.1.3 放射免疫分析試劑盒 人胰島素放射免疫分析試劑盒（Human Insulin Specific RIA Kit）為美國Millipore 公司產品，編號 HI-14K，該試劑盒主要用于定量測定血清、血漿中人胰島素的含量。犬 C 肽放射免疫分析試劑盒（Canine C-Peptide RIA Kit）為美國 Millipore 公司產品，編號 CCP-24HK，該試劑盒主要用于定量測定血清、血漿中犬C肽的含量。

1.1.4 儀器 Thermo Scientific Sorvall ST 16R 低溫離心機，為美國 Thermo 公司產品。GAMMA—C12γ計數儀，為美國德普公司產品（附數據處理軟件）。

Accu-Chek Performa 卓越型血糖儀及配套血糖試紙，均為羅氏公司產品。

1.1.5 實驗動物 健康成年 Beagle 犬，12 只，雌雄各半，體質量 8～10 kg，7～8 月齡，由安徽省阜陽市維光實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號 SCXK（皖）2011-001，實驗動物質量合格證0000399。實驗動物單籠飼養于全封閉觀察室，適應期 1 個月。觀察室溫度：16～26 ℃，濕度：40%～70%，光照：晝夜明暗交替時間為 12 h/12 h，通風：換氣次數不低于8次/h，實驗動物使用許可證SYXK（津）2011-0005。

1.2 方法

1.2.1 劑量設計 Humulin R 的臨床劑量（代償期）為 0.1～0.5 U/\\(kg·d?1\\)，餐前 0.5 h 給藥，3 次/d。按體表面積折合 Beagle 犬等效劑量約為 0.17～0.86U/\\(kg·d?1\\)，考慮采用健康 Beagle 犬作為實驗動物，最終選擇 0.5 U/kg 劑量作為 Insulin R 和 Humulin R藥動學的給藥劑量。

1.2.2 試驗分組及給藥 12 只健康成年 Beagle 犬在適應期結束后，隨機分成 2 組，每組 6 條，雌雄各半。第 1 次試驗，第 1 組動物于犬頸背部 sc 受試藥 Insulin R，劑量為 0.5 U/kg，給藥體積 0.1 mL/kg；第 2 組動物 sc 同劑量同體積的對照藥 Humulin R。

經 15～16 d 清洗期后進行第 2 次試驗，交叉給藥，即第 1 組 sc Humulin R，第 2 組 sc Insulin R，劑量和給藥體積同前。動物給藥后 6 h 統一飼喂。

1.2.3 樣品收集與存放 受試動物于頸背部 scInsulin R 和 Humulin R，給藥體積為 0.1 mL/kg。于0 h（藥前）、0.17、0.33、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6 h（藥后），從前肢頭靜脈采血約 2 mL，一滴全血即刻用于血糖測定，其余肝素鈉抗凝，低溫（4 ℃）3 000 r/min 離心 20 min，制備血漿，分裝 2管。其中 1 管加入抑肽酶（500 kU/mL 血漿）以防C 肽發生蛋白水解。所有待測樣品于?20 ℃保存，直至測定。

1.2.4 Beagle 犬校正后血藥濃度測定 由于正常動物體內含內源性胰島素，將干擾血藥濃度測定。通常胰島素和 C 肽在體內是等分子分泌，測定血漿中犬 C 肽水平可用于校正內源性胰島素的水平。本研究采用定量檢測特異性犬 C 肽試劑盒，與胰島素同步檢測血漿中犬C肽濃度以扣除犬內源胰島素對外源性胰島素測定的影響。具體方法為：Iex\\(t\\)=It0\\(t\\)－[C\\(t\\)I\\(t=0\\)/C\\(t=0\\)]，其中 Iex\\(t\\)是注射后 t 時間的校正胰島素濃度，It0\\(t\\)是注射后 t 時間的總胰島素濃度，C\\(t\\)是 t 時的 C 肽濃度，I\\(t=0\\)]是初始內源性胰島素濃度，C\\(t=0\\)是初始時 C 肽濃度[6-7]。采用 RIA 法測定的各時間點胰島素濃度減去相應時間點的 C 肽濃度后，得到校正后的胰島素濃度。

1.2.5 藥效學/藥動學參數及生物等效性計算 所有試驗數據均以?x ± s 表示，血藥濃度–時間測定數據采用 DAS 3.0（北京博之音科技有限公司）藥動程序，非房室模型擬合計算藥動參數，包括清除率（CLz）、表觀分布容積（Vz）、消除半衰期（t1/2），達峰時間（tmax）和峰濃度（Cmax）采用實測值，藥時曲線下面積（AUC）采用統計矩法計算。藥效參數最低葡萄糖濃度（Cmin）和達到最低濃度所需時間（tmin）采用實測值。生物利用度以 F 表示，F=AUC\\(0~t\\) Insulin R/AUC\\(0~t\\) Humulin R×100%，并采用雙向單側 t 檢驗、90%置信區間分析對兩種制劑進行生物等效性評價。

2 結果

2.1 血糖測定結果

12 只健康 Beagle 犬交叉 sc 受試藥 Insulin R 和對照藥 Humulin R 后吸收迅速，藥后 10 min 血糖水平已顯著低于給藥前水平（4.9/3.7 mmol/L vs 4.9/3.9mmol/L），隨后血糖水平持續降低，并于 0.5～2 h達到谷值（1.9 mmol/L vs 1.8 mmol/L），2 h 后血糖水平逐步回升，于 5～6 h 恢復至給藥前水平。兩藥平均血糖濃度–時間曲線的比較見圖 1?！?】

2.2 RIA 法測定血漿胰島素濃度

2.2.1 標準曲線、線性范圍和最低定量限 標準曲線是用藥盒提供的胰島素對照品溶液（Insulin，kit）、Insulin R 和 Humulin R 分別配制，其終濃度分別為3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μU/mL。按“Millipore 人胰島素特異試劑盒測定原理及方法”項下測定各標準管的 cpm 值，每個濃度雙復管。結果按機內程序選用自動二次擬合程序進行數據處理，繪制標準曲線。在 3.125～200 μU/mL 時，藥物濃度對數與 B/B0呈 Logistic 線性相關。結果顯示，胰島素對照品、Insulin R 和 Humulin R 標準曲線基本平行。每批試驗均制備各自標準曲線。Insulin R和 Humulin 平均標準曲線方程分別為：Y＝6.806＋87.515/[1＋\\(X/30.755\\)1.301]（n=16 條）和 Y＝6.365＋88.087/[1＋\\(X/30.889\\)1.267]（n=14 條）。本方法的最低定量限為標準曲線的最低濃度點，即3.125 μU/mL。

2.2.2 精密度和準確度試驗 在標準曲線范圍內用對照品稀釋液將 Insulin R 和 Humulin R 稀釋成低、中、高濃度（7.5、28、130 μU/mL），測定批內和批間的精密度和準確度，每個濃度重復測定 6 次。結果見表 1?！?-3】

2.2.3 穩定性試驗 分別配制 7.5、28、130 μU/mLInsulin R 和 Humulin R 質控樣品，分別在?20 ℃儲存 60 d、?20 ℃儲存 1 d、4 ℃儲存 1 d 和單次凍融4 種不同條件下保存，次日上午室溫下解凍后立即測定，每個樣本重復測定 4 次，見表 2。結果顯示，在?20 ℃條件下，保存 60 d、1 d、或中途在 4 ℃下解凍 1 d 再凍存，以及在 4 ℃保存 1 d，各濃度樣品的測定結果與?20℃條件下保存 1 d 樣品的測定比較，差異均無顯著性。2.2.4 稀釋度試驗 制備高濃度 Insulin R 和Humulin R 的犬血漿樣品（400 μU/mL），用犬空白血漿倍比稀釋，稀釋度分別為 1∶4、1∶8、1∶16，稀釋后樣品用本方法測定。檢測實測值與期望值間的關系，并計算期望指數（實測值/期望值×100%）。

Insulin R 和 Humulin R 期望指數分別在 94.0%～86.6%、108.5%～83.7%，結果表明當稀釋度不大于1∶16 時，用犬空白血漿稀釋樣品對測定結果影響不大。

2.2.5 特異性試驗 選擇胰島素原、胰高血糖素、生長抑素、促黃體生成素、卵泡刺激素 5 種多肽或蛋白類激素進行特異性試驗。配制相當于 Insulin R和Humulin R標準曲線最高濃度的20、5、0.8倍（4.0、1.0、0.16 mU/mL）進行測定。結果顯示，所測定的濃度值均低于本方法的最低定量限，表明上述被檢蛋白對測定結果均不存在明顯干擾。

2.3 RIA 法測定 Beagle 犬血漿 C 肽水平

2.3.1 標準曲線、線性范圍和最低定量限 標準曲線是用藥盒提供的犬 C 肽標準品，制備其終質量濃度為 0.172、0.344、0.688、1.375、2.75、5.5、11、22 ng/mL。按“Millipore 犬 C 肽試劑盒測定原理及方法”項下測定各標準管的 cpm 值，每個濃度雙復管。結果按機內程序選用自動二次擬合程序進行數據處理，制得標準曲線。在此濃度范圍（0.172～22ng/mL）時，藥物濃度對數與 B/B0呈 Logistic 線性相關。每次試驗均制備一條標準曲線，平均標準曲線方程為 Y＝0.498＋98.325/[1＋\\(X/2.407\\)1.054]。本方法的最低定量限為標準曲線的最低濃度點，即0.172 ng/mL。

2.3.2 精密度和準確度試驗 用標準品稀釋液配制犬 C 肽濃度，即在標準曲線范圍內選擇低、中、高濃度（0.7、1.8、7.0 ng/mL），測定 C 肽批內和批間的精密度和準確度，每個濃度重復測定 6 次和 8 次。

結果 C 肽批內和批間的精密度分別為（10.8±7.3）%、（5.9±2.5）%，批內和批間的準確度分別為（94.8±3.8）%、（96.6±4.6）%，見表 3?！?】

2.3.3 穩定性試驗 分別配制 0.7、1.8、7.0 ng/mL C肽質控樣品，分別在?20 ℃儲存 60 d、?20 ℃儲存1 d、4 ℃儲存 1 d 和單次凍融 4 種不同條件下保存，次日上午室溫下解凍后立即測定，每個樣本重復測定 4 次。結果顯示，在?20 ℃條件下，保存 60、1 d、抑或中途在 4 ℃下解凍 1 d 再凍存，以及在 4℃保存 1 d，各濃度樣品的測定結果與?20 ℃條件下保存 1 d 樣品的測定比較，差異均無顯著性。2.3.4 稀釋度試驗 由于 C 肽為 Beagle 犬血漿中的內源性物質，血漿濃度較低，無需進行稀釋，因此未進行 C 肽稀釋度的考察。

2.3.5 特異性試驗 本試劑盒與犬 C 肽交叉率為100%，人 C 肽為 15%，人前胰島素為 0%。

2.4 Beagle 犬血漿中 Insulin R、Humulin R 及犬 C肽水平測定

由于正常動物體內含有內源性胰島素，測定Beagle 犬血漿 C 肽濃度以校正內源性胰島素水平。

采用RIA法測定的各時間點胰島素濃度減去相應時間點的 C 肽濃度后，得到校正后的胰島素濃度，12只健康 Beagle 犬交叉 sc 受試藥 Insulin R 和對照藥Humulin R 后的平均藥時曲線見圖 2。

Beagle 犬分別 sc Insulin R 和 Humulin R 后，藥物吸收較快，約在 0.5 h 到達峰濃度；在血藥濃度升高的同時，伴隨著血糖的降低，約在 1 h 時降至最低；隨著血藥濃度的降低，血糖水平也逐漸升高，藥后 5 h 基本恢復到給藥前的血糖基礎水平，此時血藥濃度僅維持在最高濃度的 1/50（個別動物已檢測不到）。Insulin R 和 Humulin R 兩者的變化趨勢基本一致。見圖 3。

2.5 藥動學參數計算

將校正后的胰島素濃度數據用 DAS 3.0 藥動學計算程序進行數據處理，計算藥動學參數，見表 4。

藥時曲線下的殘留面積 AUC6 h-∞占總面積 AUC0-∞比例的均值分別為（2.0±2.2）%、（1.3±0.8）%，符合小于 20%的要求，表明采樣終點適宜，所得血藥濃度及藥動學參數均能反映這兩種注射劑的動物體內代謝過程?！?-7】

2.6 Insulin R 與 Humulin R 的生物等效性檢驗

對 Insulin R 與 Humulin R 注射劑 3 個主要藥動學參數 AUC0-6 h、AUC0-∞和 Cmax進行方差分析，結果顯示 Insulin R 與 Humulin R 在藥劑間、周期間和個體間差異均無顯著性。并對 AUC0-6 h、AUC0-∞和Cmax進行雙向單側 t 檢驗和 90%置信區間分析，AUC0-6 h、AUC0-∞和 Cmax高側和低側 t 檢驗的等效性檢驗均合格（P＜0.05），其 90%置信區間分別為93.8%～121.2%、94.9%～121.6%、83.5%～135%。

用非參數檢驗法（配對 Wilcoxon 檢驗）檢驗 tmax，Insulin R 與 Humulin R 的 tmax差異無顯著性。該研究結果表明兩種制劑具有生物等效性。

3 討論

胰島素是胰腺 β 細胞分泌合成的一種多肽類激素。其主要功能是通過調節細胞的葡萄糖攝取，糖原、脂肪合成及葡萄糖氧化等生化作用來調控血糖水平。胰島素分泌進入血液循環主要受血糖水平的控制，但亦受其他因素影響，如神經、腸道激素和其他 β 細胞分泌激素。Millipore 生產的人胰島素RIA 試劑盒，可用于測定人及犬血中的胰島素。在進行血藥濃度檢測時，犬內源性胰島素會干擾目標蛋白的測定結果。如何消除內源物質的干擾是研究胰島素藥動學的關鍵所在。由于胰島素和 C 肽在體內是等分子分泌的，測定血漿中 C 肽水平可以校正內源性胰島素的水平。本研究采用定量檢測犬 C 肽試劑盒，與胰島素同步檢測血漿中犬 C 肽濃度以校正犬內源胰島素對外源性胰島素測定的影響。另外Beagle 犬給藥 6 h 后統一進食，使基礎胰島素分泌相對較低和穩定，進而對藥效學及藥動學的影響相對較小。