骨骼肌是人體最大的含氮組織，是燒傷膿毒癥時機體蛋白質喪失的主要來源。泛素 - 蛋白酶體途徑在燒傷膿毒癥骨骼肌蛋白的降解中起到一定作用，但其不能降解肌動球蛋白復合體（骨骼肌大分子原件）和肌原纖維，說明還有其他蛋白酶在泛素- 蛋白酶體途徑之前起作用。

本研究采用體外培養骨骼肌細胞，測定凋亡效應相關蛋白酶 cys 蛋白酶－3（caspase-3）對骨骼肌細胞蛋白降解率的影響，探討骨骼肌蛋白消耗的機制和可能的調控因子，為臨床干預或調控骨骼肌萎縮和肌肉蛋白高消耗提供新的依據。

1、 材料和方法

1.1 材料與試劑 ：肌動球蛋白復合體（Sigma-Aldrich 公司），Caspase-3 （默克公司），Ac-DEVD-CHO（Caspase-3 的小分子四肽抑制劑，默克公司），低糖 DMEM，特級胎牛血清，馬血清，青霉素，乳鼠。

1.2 方法

1.2.1 骨骼肌細胞的分離純化與培養：取胎齡 2天的 Wistar 乳鼠，斷頸法處死，無菌條件下獲取四肢肌肉組織，將其存放于培養瓶中，37℃細胞培養孵箱內倒置放置 3h 后，翻轉培養瓶，含 10%胎牛血清的 DMEM 覆蓋組織小塊，維持 3～6h；在培養瓶中加入 0.125%胰蛋白酶等量，37℃細胞培養孵箱內進行消化，隨時吸取少量消化液在倒置顯微鏡下觀察，如組織塊已經變白、稀疏，或者發現組織已分散成細胞團或單個細胞，立即加入含 10%胎牛血清的DMEM 終止消化。150 目不銹鋼細胞篩過濾，去除大的未消化完全的組織塊，過濾液 800～1000rpm 低速離心 10min，去除上清，加入含血清培養基，輕輕吹打使成細胞懸液，計數后按一定的比例接種于25ml 培養瓶中培養。將生長于蓋玻片上的細胞進行MHC（肌球蛋白重鏈）免疫組化染色行骨骼肌細胞的鑒定后，將培養的骨骼肌細胞用 0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA 復合消化傳代。

1.2.2 刺激骨骼肌細胞融合為肌管：采用含 10%胎牛血清的培養基主要保證骨骼肌細胞的生長，骨骼肌細胞不能反映骨骼肌組織的生理狀態。必須將骨骼肌細胞融合為肌管后再進行研究。本研究采用含2%馬血清的 DMEM 培養刺激骨骼肌細胞融合為肌管。鏡下可見骨骼肌細胞收縮。

1.2.3 caspase-3 體外對肌動球蛋白復合體的作用：反應采用 20μl 體系，在反應緩沖液中分別加入0.5μg、1μg、2μg、4μg、8μg 的肌動球蛋白復合體，然后加入 1 單位的重組 Caspase-3，混合物在 37℃孵育 3h，加入 50nM Ac-DEVD-CHO 中止反應，按照Western Blot 步驟，混合物置于 SDS-PAGE 電泳，抗actin 抗體（作用于 14kDa-actin）雜交，分辨率 400的樂凱膠卷拍照。

1.2.4 Caspase-3 與骨骼肌蛋白降解間的關系：將離體培養的骨骼肌細胞分為 3 組，第一組為正常對照，第二組加入 1 單位 Caspase-3，第三組加入 50nM Ac-DEVD-CHO，體系中均加入 2mM ATP\\(三磷酸腺苷\\)，37℃恒溫孵育 3h，10%SDS 變性液中止反應。

然后在培養瓶中加入細胞裂解緩沖液，振蕩器混勻，1 600g 離心去除細胞核以及細胞殘渣，測定加入不同物質后對骨骼肌細胞蛋白降解率的影響，骨骼肌細胞的蛋白降解率通過測定反映骨骼肌總蛋白降解率的酪氨酸和肌纖維蛋白降解率的 3- 甲基組氨酸的濃度，用氨基酸全譜分析儀測定反應終產物中酪氨酸和 3- 甲基組氨酸的含量。

1.3 統計學處理：所有數據均以 x±s 表示，統計學處理采用 SPSS12.0 軟件進行 t 檢驗、方差分析，P<0.05 為差異顯著，P<0.01 為差異非常顯著。

2、 結果

首先進行肌動球蛋白復合體電泳，結果可見所獲得的條帶非常均一（圖 1）。在 20μl 體系中分別加入 0.5μg、1μg、2μg、4μg、8μg 的肌動球蛋白復合體和 1 單 位 的 重 組 Caspase-3， 均 可 見 到14kDa-actin 條帶，而肌動球蛋白復合體在 0.5μg、1μg 劑量時條帶消失，在 2μg、4μg、8μg 時條帶逐漸增大（圖 2）。

研究結果可見，在正常骨骼肌細胞中，總蛋白降解率為 907 nmol/gPro/h，給予 caspase-3 后總蛋白降解率為 1242 nmol/gPro/h，增加 36.9%，給予 DEVD 后總蛋白降解率為 747nmol/gPro/h，下降17.7%\\(圖 3\\)；對于肌纖維蛋白降解率，正常對照組為 3.147 nmol/gPro/h，給予 caspase-3 后肌纖維蛋白降解率為 5.238 nmol/gPro/h，增加 66.4%，給予 DEVD 后總蛋白降解率為 2.276nmol/gPro/h，下降 27.7%（圖 4）。

3、 討論

凋亡是生物界較為常見的一種細胞自殺行為，在凋亡過程中主要由 caspases 家族即半胱氨酸依賴－天門冬氨酸識別的蛋白酶實施細胞形態學的變化及生化改變。其中 Caspase3 是執行凋亡的主要酶，存在于細胞漿和細胞核。它在組織中廣泛分布，在淋巴細胞發育中高度表達，參與免疫系統的調節。國外研究人員發現，抑制 caspase-3 活性，則肌管、肌肉特異性蛋白和肌肉纖維的形成明顯減少，并提出 caspase-3 介導的信號系統參與肌肉的發生。既往研究表明，膿毒癥條件下，可以同時發生嚴重的炎癥反應和免疫細胞的凋亡，但有關燒傷膿毒癥時骨骼肌細胞和凋亡之間的關系目前尚未見報道。

本研究結果顯示，caspase 系統在骨骼肌蛋白降解中具有重要作用。為了判斷 caspase 3 是否可以降解復合體，實驗中將可溶性肌動球蛋白復合體與 caspase 共同孵育。孵育前將肌動球蛋白復合體置于非變性 SDS-PAGE 電泳，結果見到單一的蛋白條帶，表明所獲取的肌動球蛋白復合體純度較高。與 caspase 3 在 37℃共同孵育后，采用特異作用于14kDa 的 actin 抗體，發現 14kDa 的片段。表明caspase 3 在體外可以降解肌動球蛋白復合體，并且特征性 14kDa 的 actin 片斷存在反應產物中。

為了進一步證明 caspase 3 在骨骼肌蛋白降解中的作用，實驗在離體培養的骨骼肌細胞中分別加入 caspase 3 及其抑制劑 DEVD。結果發現加入caspase 3 后，骨骼肌總蛋白降解率增加了 36%，肌纖維蛋白降解率增加了 66%，而給予 caspase 3 抑制劑 DEVD 后則抑制蛋白降解，骨骼肌總蛋白降解率降低了 18%，肌纖維蛋白降解率降低了 29%。該研究結果表明，caspase 3 不僅可以體外降解肌動球蛋白復合體，而且還能改變骨骼肌蛋白降解率。

本研究表明，caspase-3 在骨骼肌蛋白降解中發揮了重要作用，參與了骨骼肌細胞的凋亡。