哺乳動物大腦皮質的發育長期以來都是發育生物學研究的焦點和熱點。目前用于研究大腦發育的組織化學技術主要有原位雜交技術和免疫熒光染色，而這些技術均需要前期的標本制備，尤其是取材后的組織固定。組織固定的主要目的是盡可能保持組織內待檢測物的原位性、完整性和免疫活性，所以組織固定的效果往往決定著組化實驗最終結果的成敗。4% 多聚甲醛\\( paraformaldehyde，PFA\\) 因其優良的理化性質成為目前固定標本組織的常用固定劑之一，而關于其配制方法，尤其是用于溶解它的溶劑的選擇目前還未有定論。本研究以此問題為出發點，比較不同溶劑的 4%PFA 對鼠腦組織的固定效果，探討最佳的組織固定方法。

1 材料與方法

1. 1 材料: 1\\) 實驗動物: SPF 級懷孕的 CD1 小鼠，雌性，取材時的孕期分別為 10. 5 d\\( E10. 5\\) 、E11. 5、E12. 5、E16. 5d\\( 北京大學醫學部實驗動物處\\) 。2\\) 化學試劑: 0. 1 mol/L PB 緩沖液\\( pH 7. 4\\) : 81 mmol/L Na2HPO4，19 mmol/L NaH2PO4;0. 01 mol / L PBS 緩沖液 \\( pH 7. 4 \\) : NaCl 137 mmol / L，KCl2. 7 mmol / L，Na2HPO410 mmol / L，KH2PO42 mmol / L \\( 上海生工公司\\) ; PFA\\( Sigma 公司\\) ; Pax6 抗體和 Ctip2 抗體\\( Ab-cam 公司\\) ; 地高辛抗體\\( Ｒoche 公司\\) 。3\\) ＲNA 探針: 所需cDNA 均從小鼠大腦中獲得，連接于 pGEM-3zf 載體，利用單酶切線性化質粒，體外轉錄后再乙醇沉淀回收 ＲNA 探針。
1. 2 切片制備: 1\\) 標本采集: CD1 孕鼠斷頸處死，剖腹，將胚胎取出后放入預冷的 0. 9% 氯化鈉注射液中，E12. 5 及更早的胚胎整胚固定，E16. 5 鼠胚取腦，浸入4% PFA\\( 0. 01 mol/LPBS 或 0. 1 mol / L PB\\) 固定過夜。第 2 天用 25% 蔗糖溶液\\( 0. 01 mol/L PBS 或 0. 1 mol/L PB\\) 脫水，24 h 后包埋，于－ 80 ℃ 冰箱中冷凝備用。2\\) 切片: 以 16 μm 厚度切片。
1. 3 原位雜交: 組織切片于 4% PFA 20 min，PK 緩沖液\\( 2 μg/mL蛋白酶 K\\) 常溫 10 min，再 DEPC-4% PFA 10 min，0. 1 mol / L 三乙醇胺\\( 不含 ＲNA 酶\\) 常溫攪拌 10 min，常溫預雜交 1 h，65 ℃雜交過夜\\( 探針終濃度為 0. 5 ng/μL\\) ; 65 ℃0. 2 × 檸檬酸鈉緩沖液 洗 20 min × 3 次，地高辛抗體1∶ 5 000，4 ℃ 孵育過夜; 利用四唑硝基藍 /5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽\\( Ｒoche\\) 系統進行顯色反應，使用純水終止反應，放到 100%甲醇中處理 20 min，封片，拍照。
1. 4 免疫熒光染色: 組織切片于 1 × PBS 中浸泡 5 min，封閉液室溫封閉 20 ～30 min，一抗 4 ℃過夜\\( 一抗稀釋比例: Pax61∶ 200，Ctip2 1v500\\) ; 1 × PBS 洗 5 min × 3 次，二抗\\( 1∶ 200\\) 室溫孵育 1. 5 ～ 2 h，PBS 洗 5 min × 3 次，DAPI 染色，室溫 3 ～5 min，1 × PBS 洗 3 min × 1 次，封片，用 Olympus confocal 共聚焦熒光顯微鏡 P1000 拍照記錄。

2 結果

2. 1 原位雜交結果: 可見 4% PFA\\( 0. 1 mol / L PB\\) 固定的組織不僅較 4% PFA\\( 0. 01 mol/L PBS\\) 的致密和形態完好，而且原位雜交背景也明顯降低，明顯提高了信噪比\\( 圖 1\\) 。2. 2 免疫熒光染色結果: 如圖可見，轉錄因子 PAX6 蛋白抗體用 0. 01 mol/L PBS 免疫熒光染色的結果更清楚、背景更低; 而用 0. 1 mol/L PB 則較模糊和高背景，CTIP2 蛋白抗體用0. 01 mol/L PBS 的非常清晰，而0. 1 mol/L PB 的結果卻幾乎不能用于實驗分析\\( 圖 2\\) 。
3 討論

本實驗通過比較兩種緩沖系統的 PFA 固定小鼠大腦組織后的原位雜交、免疫熒光染色的結果的差別，發現0. 1 mol / L PB 作為溶劑固定的組織更適合原位雜交，而0. 01 mol / L PBS 更適合于免疫熒光染色。但造成這一差異的具體機制，尚待進一步研究。
總之，為了得到較好的原位雜交和免疫熒光的結果，不僅需要豐富的經驗和熟練的技術，而且還要注意根據待固定的組織特性和具體的實驗條件來選擇不同緩沖系統的固定液。

參考文獻:
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