一、膽汁酸的合成與轉運
膽汁酸是膽固醇代謝的主要產物，膽汁的主要成分，調節多個生物過程，包括刺激肝臟膽汁分泌和促進小腸吸收脂肪及脂溶性維生素。膽汁酸也可通過激活特異性的受體和信號通路調節甘油三酯、膽固醇和葡萄糖的穩態平衡。
肝臟是合成膽汁酸的唯一器官。90% ~95% 的膽汁酸直接由肝細胞內的膽固醇代謝產生。合成途徑包 括 膽 固 醇 7α-羥 化 酶 （ cholesterol 7 alpha-hydroxylase,CYP7A1） 介導的經典途徑和類固醇 27羥化酶（ sterol 27-hydroxylase,CYP27A1） 介導的替代途徑兩種。
腸道內的膽汁酸僅 5% 由糞便排出，95% 在回腸末端被重吸收入血進行腸-肝循環。其中結合膽汁酸的重吸收與轉運過程由兩個轉運蛋白超家族協同完成（ 圖 1,表 1） : 溶質載體（ solute carrier,SLC）超家族介導入細胞過程，不消耗 ATP; ATP 結合盒（ ATP-bingding cassette,ABC） 轉運體超家族介導出細胞過程，消耗 ATP[1].?；撬?甘氨酸結合膽汁酸（ taurine and glycin conjugated bile acids,T/G-BA） ,在回腸的重吸收主要由頂側膜的頂膜鈉依賴性膽汁酸轉運體（ apical sodium dependent bile acidtransporter,ASBT） （ SLC10A2） 和基底膜的有機溶質轉運體（ organic solute transporter alpha-beta,OSTα-OSTβ） （ SLC51A-SLC51B） 協同完成[2].而細胞內運輸由回腸脂質結合蛋白（ ileal lipid binding pro-tein,ILBP） 與膽汁酸結合。膽汁酸隨門靜脈血流運回肝臟，經肝細胞竇狀隙膜的鈉-?；悄懰峁厕D運多肽（ Na-taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP）（ SLC10A1） 進入肝細胞，再與新合成的結合膽汁酸一起由肝細胞膽小管膜的膽鹽輸出泵（ bile salt ex-port pump,BSEP） （ ABCB11） 分泌入膽道系統。
除了占大多數的 T/G-BA,少量硫酸鹽或葡萄糖醛酸結合膽汁酸（ sulfate and glucuronide conjuga-ted bile acid,S / U-BA） 由腸上皮細胞基底膜的多藥耐藥相關蛋白-3 （ multidrug resistance-associated pro-tein-3,MRP3） （ ABCC3 ） 泵入門靜脈系統，再由肝細胞膽小管膜的 MRP2 （ ABCC2） 分泌入膽道系統（ 圖 1,表 1） .腸上皮細胞頂側膜的 MRP2 將結合膽汁酸運回腸腔。少量羥基化膽汁酸 （ hydroxylatedbile acid,H-BA） 由肝細胞膽小管膜的多藥耐藥蛋白-1 （ multidrug resistance protein 1, MDR1 ）（ ABCB1） 分泌入膽道系統。游離膽汁酸在小腸各部和大腸通過彌散作用被動重吸收，由肝細胞竇狀隙膜的有機陰離子轉運蛋白 1B1 （ organic aniontransport protein 1B1, OATP1B1 ） （ SLCO1B1 ） 和OATP1B3 （ SLCO1B3） 攝入肝細胞[2].
部分膽汁酸不經肝臟過濾進入體循環，但在腎臟經腎小球濾過后被近球小管的 ASBT 和 OSTα-OSTβ 重吸收回體循環，尿液排出的膽汁酸量極少。膽汁淤積時肝細胞竇狀隙膜的 OSTα-OSTβ、MRP3和 MRP4 （ ABCC4） 將各類結合及游離膽汁酸排入體循環，經尿液排出，具有一定的代償意義。
二、膽汁酸穩態的調節
核受體（ nuclear receptor,NR） 超家族成員法尼酯衍 生 物 X 受 體 （ farnesoid X receptor,FXR）（ NR1H4） 作為轉錄因子，廣泛參與膽汁酸穩態各環節的調節（ 表 1） .FXR 通常與視黃醛衍生物 X 受體 α （ retinoid X receptor alpha,RXRα） （ NR2B1）形成異二聚體 FXR/RXRα，被激活后與靶基因啟動子區 FXR 反應元件（ FXR response element,FXRE）結合，直接上調 OSTα、OSTβ、ILBP、BSEP、OATP1B1和 OATP1B3 等 基 因 的 轉 錄[3,4]. 而 FXR 對CYP7A1、ASBT 和 NTCP 等基因的轉錄具有抑制作用，主要由以下兩條通路介導[3,5]: （ 1） FXR-SHP-LRH-1 通 路，其中小異二聚體伴侶 （ small het-erodimer partner,SHP） （ NR0B2） 是 FXR 的直接靶基因，被誘導上調后，作為轉錄抑制因子與肝受體同系物-1 （ liver receptor homolog-1,LRH-1） （ NR5A2）結合，抑 制 LRH-1 的 轉 錄 激 活 作 用； （ 2） FXR-FGF15 /19 通路，成纖維細胞生長因子 15 /19 （ fibro-blast growth factor 15,FGF15〈小鼠〉，FGF19〈人〉）被 FXR 誘導上調后分泌入門靜脈，隨血流與肝細胞表面的 FGF 受體4 （ FGF receptor 4,FGFR4） 結合，激活下游信號通路抑制靶基因轉錄。CYP7A1 受FXR-SHP-LRH-1 和 FXR-FGF15 /19 兩條通路的負反饋抑制作用[3].而 SHP、OSTα 和 OSTβ（ Franken-berg 等。 2006） 均受到 FXR 激活和抑制作用的動態調節[5,6].CYP7A1 的轉錄也受肝 X 受體 α （ liver X re-ceptor alpha,LXRα） （ NR1H3） 的直接上調[5].膽固醇代謝合成膽汁酸的中間產物---氧化甾醇可激活 LXRα，對 CYP7A1 進行前饋調節； 而膽汁酸可激活 FXR,對 CYP7A1 進行負反饋調節[5].有趣的是LXRα / RXRα 與 FXR / RXRα 均可直接上調 OSTα、OSTβ、ILBP 及 OATP1B1 的表達[4,5,7].
三、選擇性剪接的調節與功能
真核生物的結構基因中含有具有表達活性的外顯子，還含有無表達活性的內含子。轉錄時，外顯子及內含子均轉錄到 mRNA 前體 （ pre-mRNA） ,再通過剪接作用剪切掉內含子，連接外顯子，得到成熟mRNA.而同一個 pre-mRNA 可通過不同的剪接方式產生不同的 mRNA,稱為選擇性剪接（ 或可變剪接） .哺乳動物體內編碼蛋白質的基因數目與線蟲和擬南芥近似，與生物體和細胞的復雜性嚴重不符。
而選擇性剪接是增加真核生物多樣性的重要機制之一。有 研 究 認 為94 % 的 人 類 基 因 具 有 選 擇 性剪接[8].剪接過程由剪接體（ spliceosome） 催化，它是由五個含有小核 RNA （ small nuclear RNA,snRNA） 的小核核糖核蛋白（ small nuclear Ribonucleoprotein,snRNP） 及其他非 snRNP 蛋白質組成的大分子核酸蛋白復合物。剪接體識別內含子中的 5‘剪接位點、3' 剪接位點及分支位點，完成內含子的切除和外顯子的連接。剪接位點的識別受到多個順式調控元件與反式調控因子的控制，順式調控元件包括外顯子剪接增強子（ exon splicing enhancer,ESE） 、外顯子剪接沉默子（ exon splicing silencer,ESS） 、內含子剪接增強子（ intron splicing enhancer,ISE） 和內含子剪接沉默子（ intron splicing silencer,ISS） .剪接調控因子主要包括富含絲氨酸（ serine,S） 和精氨酸 （ ar-ginine,R） 結構域的 SR 蛋白 （ SR protein） 和核不均一核糖核蛋白（ heterogeneous nuclear Ribonucleo-protein,hnRNP） .SR 蛋白主要與剪接增強子結合，提高相鄰剪接位點的活性。hnRNP 主要與剪接沉默子結合，抑制相鄰剪接位點的活性。
興奮性與抑制性剪接調控因子的相對濃度、磷酸化狀態、pre-mRNA 的二級結構均會影響剪接位點的選擇。而 microRNA （ miRNA） 通過對剪接調控因子 mRNA 降解或翻譯抑制，間接影響選擇性剪接。由于 RNA 轉錄與剪接在空間和時間上緊密偶聯，轉錄延伸的速率（ 即 RNA 聚合酶 II 的移動速率） 不同可影響強、弱剪接位點的識別，延伸的速率減慢促進弱剪接位點的識別，導致選擇性外顯子的納入。染色質構型、核小體定位、組蛋白修飾和DNA 甲基化可通過影響蛋白招募，或改變 RNA 聚合酶 II 的移動速率影響選擇性剪接[18].
由選擇性剪接產生的轉錄變異體通常具有組織分布或發育階段特異性。轉錄變異體的結構變化通常分為三類： （ 1） 選擇性剪接使 mRNA 產生提前終止密碼子（ premature termination codon,PTC） ,引起無 意 義 介 導 的 降 解 （ nonsense-mediated decay,NMD） ,為真核生物控制 mRNA 質量的重要措施；（ 2） 5’或 3' 非翻譯區的改變，影響 mRNA 的穩定性或翻譯，甚至第一外顯子的改變伴有啟動子改變，產生不同的轉錄調節模式； （ 3） 蛋白結構改變，影響蛋白的亞細胞定位與功能[19].選擇性剪接改變蛋白結構具體包括： 1） 通過改變定位信號、翻譯后修飾序列或與其他蛋白的相互作用位點而改變蛋白的亞細胞定位。亞細胞定位的改變也常伴有功能改變，尤其是膜結合型受體，其分泌型剪接變異體分泌入血會顯著抑制正常的信號傳導。2） 改變細胞的生命進程，選擇性外顯子的納入或跳過，引起剪接變異體促凋亡/抗凋亡、增殖/抗增殖特性轉換，影響血管新生，與腫瘤發育密切相關。3） 對轉錄因子的影響，選擇性剪接改變反式激活結構域可影響 RNA 聚合酶 II 的活化，刪除 DNA 結合域則導致與靶基因啟動子結合能力喪失，轉錄因子可能無活性，也可能取代正常轉錄因子而產生顯性失活作用。4） 影響酶的底物特異性或活性，通常使酶活性降低或喪失，但某些激酶的自身抑制作用被選擇性剪接改變，也會產生組成性活化的激酶。5） 影響離子通道的開放時間、開放電壓、離子特異性及對配體的反應性等各個方面[19].
四、膽汁酸穩態調節的選擇性剪接
（ 一） FXR 核受體 FXR （ NR1H4） 有四種剪接變異體 FXRα1、FXRα2、FXRβ1 和 FXRβ2.FXRα和 FXRβ 具有不同的氨基端，而 FXRα1 和 FXRβ1在臨近 DNA 結合域的鉸鏈區多 4 個氨基酸殘基（ a-mino acid residue,aa） 的插入片斷，導致其與靶基因啟動子 FXRE 結合的親和力降低。四種剪接變異體的組織表達分布不同，除了全部在肝臟高表達，FXRβ1 與和 FXRβ2 在回腸高表達，在腎臟中度表達，在胃、十二指腸和空腸低表達（ β1 與 β2 各占50% ） ; 而 FXRα1 與 FXRα2 在回腸和腎上腺中度表達（ α1 與 α2 各占 50%） .四種變異體對靶基因的轉錄激活能力也存在差異，其激活 SHP 和 BSEP 的能力相當，而激活 ILBP 的能力 FXRβ2 > FXRα2 》 FXRα1 = FXRβ1,最大差異超過 20 倍[9].在FXR 全身敲除小鼠的肝臟特異性過表達 FXRα2 或FXRβ2,均可極大程度糾正 FXR 敲除所致的肝臟基因表達譜改變，但在降低已升高的 HDL 水平、轉錄抑制類固醇 12α 羥化酶 （ sterol 12α-hydroxylase,CYP8B1） 的肝表達、增加膽汁池親水性、促進中性甾醇經小腸排入糞便等方面，FXRα2 的作用強于FXRβ2.
（ 二） FGFR4 成纖維細胞生長因子受體 FG-FR4 被 FGF15 /19 激活后介導 FXR 的負調節通路。FGFR4 基因包含 18 個外顯子，蛋白為一次跨膜的受體型酪氨酸蛋白激酶，有 3 個細胞外免疫球蛋白（ immunoglobulin,Ig） 樣結構域。其中外顯子 1 不翻譯，外顯子 2 編碼信號肽，外顯子 3 編碼第 1 個 Ig樣結構域，外顯子 4 編碼酸盒（ acid box） ,外顯子 5和 6 編碼第 2 個 Ig 樣結構域，外顯子 7 和 8 編碼第3 個 Ig 樣結構域，外顯子 9 編碼跨膜區，外顯子 10-12; 14-17 編碼激酶結構域。在人乳癌細胞系發現一種可溶性 FGFR4 （ soluble FGFR4,sFGFR4） ,由于內含子 4 的保留，產生提前終止密碼子，sFGFR4 分泌到細胞外，可抑制 FGF-1 介導的信號傳導。而在人的胃腸道上皮細胞發現另一種可溶性 svFGFR4,編碼跨膜區的外顯子 9 被內含子 9 取代，蛋白分泌到細胞外。在小鼠發現兩種 FGFR4 剪接變異體FGFR4-17a 和 FGFR4-17b,分別納入內含子 17 的部分和全長序列，推測蛋白質缺少羧基端細胞內尾。小鼠生肌細胞中的 FGFR4（ -16） 缺少外顯子 16,缺失激酶結構域。而人垂體瘤來源的 FGFR4 （ pituita-ry tumor-derived FGFR4,ptd-FGFR4） mRNA 序列從外顯子 5 開始，編碼蛋白缺乏氨基端的信號肽和前兩個 Ig 樣結構域，蛋白定位于細胞漿，并且組成性磷酸化[10].
（ 三） RXRα 核受體 RXRα （ NR2B1） 在小鼠睪丸發現 2 個剪接變異體 mRXRα2 和 mRXRα3,分別用了不同的選擇性外顯子 1b 和 1c,而外顯子 2及之后的序列與原有主要亞型 mRXRα1 相同。mRXRα2 和 mRXRα3 編碼相同的蛋白，與 mRXRα1相比缺少氨基端的 28aa,轉錄激活功能域 1 （ activa-tion function-1, AF-1 ） 受 影 響。 mRXRα2 和mRXRα3 僅表達于睪丸，在青春期高表達，可能在生精過程起作用。隨后在人也發現 2 個剪接變異體hRXRα2 和 hRXRα3,hRXRα2 與 原 有 主 要 亞 型hRXRα1 共用外顯子 2 及之后的序列，編碼蛋白缺少氨基端的 27aa,hRXRα3 與 hRXRα1 共用外顯子3 及之后的序列，編碼蛋白缺少氨基端的 97aa.hRXRα3 表達于腦、脾和前列腺，而 hRXRα2 表達水平過低檢測不到。hRXRα2 和 hRXRα3 具 有 與hRXRα1 類似的轉錄活性和對配體的劑量反應曲線，但加入共激活因子后劑量反應曲線出現差異[11].
（ 四） LXRα 核受體 LXRα （ NR1H3） 已在人發現 4 個剪接變異體 hLXRα2、hLXRα3、hLXRα4、hLXRα5.hLXRα2 應用選擇性外顯子 1,伴有啟動子改變，氨基端缺少 45aa,使轉錄活性減低，僅在睪丸高表達。hLXRα3 的外顯子 6 被跳過，導致配體結合區缺少 50aa,不能與配體結合，無轉錄活性。雖 然 hLXRα3 可 競 爭 性 抑 制 原 有 主 要 亞 型hLXRα1,但不具有顯性失活作用，且 hLXRα3 在各組織低表達。hLXRα4 因保留了內含子 6 的 192bp,配體結合區有 64aa 的插入片斷，具有微弱的轉錄活性。LXRα3 和 LXRα4 在小鼠組織也有低水平表達。hLXRα5 在外顯子 7 和外顯子 8 之間納入了一個選擇性外顯子，含有終止密碼子，導致羧基端序列缺失 91aa.hLXRα5 可與輔阻遏物相互作用，過表達時抑制 hLXRα1 的轉錄活性[12].
（ 五） ASBT 頂膜鈉依賴性膽汁酸轉運體 ASBT.（ SLC10A2） 為七次跨膜蛋白，由 384 個 aa 構成，氨基端位于細胞外，羧基端位于細胞內。已發現一個選擇性剪接變異體 t-ASBT,由于外顯子 2 的跳過引起移碼，產生 154aa 的短亞型，僅保留氨基端的三個跨膜區。選擇性剪接引起轉運體的亞細胞定位和功能改變： ASBT 位于腸上皮細胞、膽管細胞和腎臟近球小管上皮細胞的頂側膜，將管腔中的膽汁酸轉運到細胞內； 而 t-ASBT 位于上皮細胞的基底膜，將細胞內的膽汁酸轉運排出細胞。在膽管細胞 ASBT 與t-ASBT 均被負反饋調節，而在腸上皮細胞二者均被正反饋調節[13].可見 ASBT 與 t-ASBT 位于細胞兩側，協同調節膽汁酸的轉運。
（ 六） NTCP 鈉-?；悄懰峁厕D運多肽 NTCP.（ SLC10A1） 為七次跨膜蛋白，由 362 個 aa 構成，氨基端位于細胞外，羧基端位于細胞內。NTCP 位于肝細胞竇狀隙膜，將門靜脈血流中的膽汁酸轉運到肝細胞內。已發現一個選擇性剪接變異體 NTCP2,最后一個內含子的保留使終止密碼子提前出現，蛋白的羧基端變短，共含 317aa.全長 NTCP 為低親和力/高容量轉運體，而短的剪接變異體 NTCP2 為高親和力/低容量轉運體[14].
（ 七） OATP1B3 位于肝細胞竇狀隙膜的有機。陰離子轉運蛋白 OATP1B3 （ SLCO1B3） 攝取游離膽汁酸，僅表達于肝臟。而在結腸癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌和肺癌等癌組織發現了一種 OATP1B3 剪接變異體的廣泛表達，稱為癌特異性 OATP1B3（ cancer-specific OATP1B3, csOATP1B3 ） .csOATP1B3 的轉錄起始于選擇性外顯子 2a,缺少外顯子 1 和 2,導 致 氨 基 酸 序 列 在 氨 基 端 缺 少28aa[15].csOATP1B3 的亞細胞定位也顯著改變，主要位于細胞漿，僅有少量轉位到細胞膜。轉錄起始位點的改變伴有啟動子改變，產生不同的轉錄調節模式[16].
（ 八） MRP4 多 藥 耐 藥 相 關 蛋 白 MRP4（ ABCC4） 定位于肝細胞竇狀隙膜，將肝細胞內的膽汁酸泵入體循環； 在腎臟定位于近球小管上皮細胞頂側膜，將腎小管上皮細胞內的膽汁酸泵入管腔，促進膽汁酸由尿液排出。研究發現在人、猴和嚙齒動物存在高度保守的 MRP4 選擇性外顯子 1a 和 1b,可組合形成 3 種選擇性剪接變異體 V1、V2 和 V3,但均會形成提前終止密碼子，引起無意義介導的降解[17].
五、結語與展望
選擇性剪接是增加真核生物多樣性的重要機制，影響著 mRNA 的轉錄調節與穩定性、蛋白質的細胞定位與功能。參與膽汁酸轉運的多種轉運體和調節膽汁酸穩態平衡的多種轉錄因子存在選擇性剪接。選擇性剪接已逐漸成為研究熱點之一。探討剪接變異體的功能、內外環境刺激選擇性剪接發生的機制與網絡調節，對于深入研究機體生理功能及疾病的發生發展規律具有重要意義。
參 考 文 獻
1 Klaassen CD,Aleksunes LM. Xenobiotic,bile acid,andcholesterol transporters: function and regulation. PharmacolRev,2010,62\ue5fe1 ~ 96.
2 Dawson PA. Role of the intestinal bile acid transporters inbile acid and drug disposition. Handb Exp Pharmacol,2011,201\ue5fe169 ~ 203.
3 Matsubara T,Li F,Gonzalez FJ. FXR signaling in the en-terohepatic system. Mol Cell Endocrinol,2013,368\ue5fe17 ~29.
4 Meyer Zu Schwabedissen HE,Bottcher K,Chaudhry A,etal. Liver X receptor alpha and farnesoid X receptor are majortranscriptional regulators of OATP1B1. Hepatology,2010,52\ue5fe1797 ~ 1807.
