0 引言

內質網應激\\(endoplasmic reticulum stress, ERS\\)是指在多種生理或病理條件下細胞內質網鈣穩態失衡或蛋白質加工運輸障礙、生理功能發生紊亂的一種亞細胞器的病理過程[1-3], 涉及內質網類似激酶\\(protein kinase RNA-like endoplas-mic reticulum kinase, PERK\\)/真核細胞翻譯起始因子2α\\(eukaryotic initiation factor 2α, eIF2α\\)、激活轉錄因子6\\(activating transcription factor6, ATF6\\)和需肌醇酶-1\\(inositol-requiring kinase1, IRE-1α\\)/X盒結合蛋白-1\\(X-box binding pro-t e i n-1, X B P-1\\)等信號通路[4-6], 而葡萄糖調節蛋白78\\(glucose-regulated protein 78, GRP78\\)是細胞ERS狀態的標志物[7,8]. 內質網氧化還原酶-1α\\(endoplasmic reticulum oxidoreductin1α, E R O1α \\)是調控內質網腔中蛋白合成、折疊的關鍵基因[9,10]. 同型半胱氨酸\\(homocyste-ine, Hcy\\)是多種疾病的危險因子, 可引起肝臟ERS[11,12]. 本研究主要探討Hcy誘導肝細胞ERS過程中ERO1α的調控作用及可能機制, 為進一步尋找Hcy致肝臟ERS中的作用靶點提供實驗依據.

1 材料和方法

1.1 材料 HL7220肝細胞株\\(四川大學華西醫學中心, 中國\\); 超凈工作臺\\(蘇州安泰空氣技術有限公司, 中國\\); CO2培養箱\\(Heraeus, 德國\\); 5415D型微量臺式離心機\\(Eppendorf, 德國\\); BS110S型精密天平\\(Sartorius, 德國\\); 熒光顯微鏡\\(奧林巴斯公司, 日本\\); 熒光定量PCR儀\\(上海楓嶺生物技術有限公司, 中國\\); 垂直電泳儀和Model680全自動酶標儀\\(Bio-Rad公司, 美國\\); HyClone RPMI1640培養基\\(Thermo\\); 胎牛血清\\(杭州四季青生物工程材料研究所\\); Hcy\\(Sigma\\); RNA提取試劑盒\\(北京天根生物技術有限公司, 中國\\); 逆轉錄和qRT-PCR試劑盒\\(美國Invitrogen公司\\); 蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒\\(南京凱基生物科技發展有限公司, 中國\\); ERO1α兔抗人一抗\\(Abcam公司\\), 辣根過氧化物酶\\(HRP\\)標記的羊抗兔二抗\\(北京博奧森生物技術有限公司, 中國\\);GRP78、PERK、ATF6、XBP-1 ELISA試劑盒\\(北京雅安達公司, 中國\\); 引物由上海生工生物工程有限公司合成.

1.2 方法

1.2.1 細胞培養: 將人肝細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基置于37 ℃、50 mL/L CO2培養箱中傳代培養. 細胞密度達到80%左右時, 用終濃度為0、50、100、200、500 μmol/L Hcy和100 μmol/L Hcy+葉酸+VB12干預, 其中0 μmol/LHcy為對照組, 48 h后收集細胞, 用于后續試驗.

1.2.2 ELISA檢測ERS相關蛋白GRP78、PERK、ATF6、XBP-1的水平: ELISA試劑盒室溫平衡15 min, 分別設空白孔、待測樣品孔. 空白孔加樣品稀釋液100 μL, 余孔分別加標準品或待測樣品100 μL\\(待測樣品蛋白上樣濃度統一為21 g/L\\),37 ℃反應30 min. 洗板5次, 各1 min, 拍干. 每孔加酶標液100 μL, 37 ℃反應30 min, 洗板5次, 各1 min, 拍干. 加顯色試劑A液和B液, 37 ℃顯色15 min. 加終止液, 15 min內, 酶標儀上讀取各孔A450值.

1.2.3 實時定量PCR檢測ERO1α mRNA水平: 按照RNA提取試劑盒說明書提取細胞RNA, 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性. 按逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA; 采用Primer5.0軟件設計引物, E R O1α: 5'-AT C C T T T G-G C T T C T G G T C A A G-3'\\(上游\\)和5'-G T T G T-GTCCCCATTTCTTTTCT-3'\\(下游\\); β-actin:
5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'\\(上游\\)和5'-CTGGAAGGTGGACAGCGACG-3'\\(下游\\).

PCR條件: 94 ℃預變性10 min, 94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延長30 s, 擴增40個循環.待反應結束后, 結合擴增曲線及溶解曲線, 選擇符合要求的qRT-PCR原始數據, 結果用2-△△CT法分析.

1.2.4 Western blot檢測ERO1α的蛋白表達改變: 細胞裂解法提取各組細胞總蛋白, 取總蛋白18 μL,經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠\\(SDS-PAGE\\)電泳, 80 V 30 min, 120 V 60 min, 15 V恒壓轉膜10 min, 與ERO1α特異性一抗4 ℃過夜; 與二抗室溫孵育1.5 h后, 加入顯色底物, 以β-actin為內參, 凝膠成像分析儀上成像分析, 計算ERO1α與β-actin灰度值的比值, 進行分析.

1.2.5 E R O1α重組質粒及s i R N A質粒構建:ERO1α重組質粒委托上海漢恒生物技術有限公司完成. ERO1α三個不同siRNA片段委托上海吉凱生物技術有限公司完成.

1.2.6 細胞轉染: 轉染前2 d取對數期生長的肝細胞接種于6孔板中, 分別用空質粒\\(pEGFP-N1\\)和ERO1α重組質粒\\(pERO1α\\)及siRNA三個不同片段轉染肝細胞, 并設立空白對照組. 操作步驟:LipofectamineTM2000\\(μL\\)和質粒DNA\\(μg\\)比例為3∶1, 分別溶于無血清培養液中, 室溫孵育5 min后將兩者混勻, 室溫孵育20 min, 與適量無血清培養液輕輕混勻后加入細胞中, 6 h后棄培養液,加入含血清的培養液繼續培養48 h后, 熒光倒置顯微鏡觀察細胞轉染效率.

統計學處理 采用Prism 6.0統計軟件對實驗數據進行分析, 計量資料以mean±SD表示, 兩組間比較采用t檢驗, 多組間兩兩比較采用單因素方差分析,P<0.05表示差異有統計學意義.

2 結果

2 . 1 H c y 對肝細胞 E R S 相關蛋白 G R P 7 8 、XBP-1、PERK及ATF6的影響 用100 ?mol/L Hcy干預肝細胞后, ERS相關蛋白GRP78、XBP-1、P E R K 及 AT F 6 的含量較對照組分別升高了1.29、1.27、1.06、1.08倍, 差異有統計學意義\\(P <0.05\\)\\(圖1\\).

2.2 不同濃度Hcy對肝細胞ERO1α表達的影響分別用0、50、100、200、500 ?mol/L Hcy干預肝細胞后, ERO1α mRNA和蛋白表達水平均有所降低. 其中50 ?mol/L組與0 ?mol/L組比較無明顯差異; 其余組隨著Hcy濃度的增加, ERO1αmRNA和蛋白表達水平均顯著減少\\(P <0.01\\), 且呈劑量依賴關系; 而給予葉酸和VB12干預后,ERO1α表達水平明顯增加\\(P <0.01\\)\\(圖2\\).

2.3 熒光倒置顯微鏡觀察肝細胞轉染效率 為了分析ERO1α對肝細胞ERS相關蛋白的調控作用,運用脂質體LipofectamineTM2000將pEGFP-N1、pERO1α重組質粒及siRNA三個不同片段轉染肝細胞48 h后, 熒光顯微鏡下觀察可見綠色熒光蛋白表達明顯, 說明轉染成功, 可以進行后續實驗\\(圖3\\).

2.4 驗證基因重組或R N A干擾質粒轉染肝細胞后ERO1α表達改變 將pEGFP-N1空質粒及ERO1α過表達質粒分別轉染肝細胞, 檢測ERO1α mRNA及蛋白表達, 結果顯示pERO1α組ERO1α mRNA及蛋白表達水平明顯增加\\(P <0.01\\)\\(圖4A, B\\), 證實pERO1α轉染成功; 將三個不同的ERO1α siRNA片段轉染肝細胞, 三個片段均可以降低ERO1α mRNA及蛋白表達明顯增加\\(P<0.01\\), 尤其以siRNA2作用最為明顯\\(圖4C, D\\).

2.5 ERO1α表達改變對肝細胞ERS相關蛋白表達的影響 為了進一步明確ERO1α在Hcy誘導肝細胞ERS中的作用, 分別將ERO1α過表達質粒及ERO1α siRNA片段轉染肝細胞并與Hcy\\(100?mol/L\\)共同孵育48 h后, 檢測GRP78、ATF6、PERK、XBP-1的表達變化, 結果顯示與Hcy組相比, Hcy+pERO1α組GRP78、ATF6、PERK、XBP-1均明顯降低\\(P <0.01\\); 而Hcy+siRNA2組,G R P78、AT F6、P E R K、X B P-1均明顯升高\\(P <0.01\\)\\(圖5\\).

3 討論

ERS反應是細胞的一種自我保護機制, 在保護機體有效應對各種外在刺激中涉及多個信號通路及相關基因的表達調控, 構成一個完整體系, 發揮維持細胞存活和凋亡平衡的重要調節作用[13,14]. 適度的ERS反應有助于保護細胞, 維持生存, 但ERS反應過強不可逆轉時則可引起細胞功能障礙, 導致細胞凋亡, 促進疾病的發生發展[15]. Hcy是一種含硫氨基酸, 是體內蛋氨酸代謝的中間產物, 正常機體中含量很低, 當Hcy代謝受阻, 就會在體內積聚, 使其在血中的水平持續升高發生高同型半胱氨酸血癥\\(hyperhomocystein-emia, HHcy\\)[16,17], 是臨床多種疾病的危險因素[18].

研究[19,20]顯示: Hcy參與心肌細胞ERS, 為ERS的誘導因素之一, 而肝臟是調節Hcy代謝的重要器官, 含有豐富的內質網, 在調節Hcy代謝過程中,更容易發生ERS反應[21,22]. GRP78是一種內質網分子伴侶, 是ERS反應的主要標志性蛋白, 在內質網非應激狀態下, PERK、ATF6、IRE1與GRP78結合處于非活性狀態, ERS時, GRP78則與這三種轉錄因子解離并啟動PERK/eIF2α、ATF6、IRE-1α/XBP-1信號轉導途徑[23]. 本實驗研究結果提示Hcy干預后, 肝細胞內GRP78、PERK、ATF6與XBP-1表達升高, 表明Hcy可導致肝細胞發生ERS.

E R O1定位于人14號染色體上, 是一種緊貼于ER膜腔面的糖基化黃素酶, 主要參與維持ER內氧化狀態[24]. ERO1參與氧化二硫鍵異構酶, 維持蛋白折疊過程能夠持續進行[25]. ERO1在形成二硫鍵的過程中可產生H2O2, 因此ERO1激活是細胞內活性氧簇\\(reactive oxygen species,ROS\\)產生的重要來源之一[26]. 過多的ROS產生,超過細胞抗氧化防御能力就會影響細胞內氧化還原穩態, 引起氧化應激和ERS等過程[27]. 人類細胞中含有兩種ERO1同源異構體, ERO1α和ERO1β. Wright等[28]發現, ERO1α限制胰島素原突變體誘導的ERS. 另有研究[29,30]發現, ERO1α蛋白可能參與高血壓誘導的血管內皮細胞損傷,并可以作為ERS導致細胞凋亡通路的重要標志蛋白, 表明ERO1α是調控內質網腔中蛋白合成、折疊的關鍵基因. 我們用不同濃度Hcy刺激肝細胞, 結果顯示, Hcy可以引起ERO1α表達下降, 且呈劑量依賴性, 提示ERO1α參與了Hcy引起的肝細胞ERS. 為了進一步明確ERO1α在Hcy致肝細胞ERS中的作用, 我們分別在肝細胞中過表達和干擾ERO1α, 結果發現過表達ERO1α后, ERS相關蛋白GRP78、PERK、ATF6與XBP-1表達減少, 而抑制ERO1α表達后ERS相關蛋白表達升高, 表明ERO1α對ERS起到負性調控作用. 因此, ERO1α可能是Hcy引起的肝細胞ERS過程的關鍵基因, 是Hcy導致肝細胞ERS過程中的一個重要開關或橋梁.