0 引言

非酒精性脂肪性肝病\\(non-alcoholic fatty liverdis eas e, N A FLD\\), 是一種以肝臟脂肪浸潤、肝細胞炎癥壞死為特征的慢性疾病, 可以由單純性脂肪肝進展至非酒精性脂肪性肝炎\\(non-alcoholic steatohepatitis, NASH\\)、肝硬化, 甚至肝細胞肝癌. NAFLD在西方發達國家發病率24%-42%, 而在糖尿病患者中發病率可達70%-80%[1,2]. 2009年Fan等[3]報道上海脂肪肝發病率為17%. 2012年我們研究[4,5]發現, 在上海工作人群中約38.1%的人患有脂肪肝, 其中男性多于女性, 隨著年齡增加, 患病率增加, 在上海老年人群中患病率可以達到57.67%. NAFLD已逐漸成為影響人民健康的常見疾病.

目前NAFLD的發病機制仍未明確, 細胞因子及胰島素抵抗在發病中起了重要作用[6]. 白介素-6\\(interleukin-6, IL-6\\)第一個報道可以預測或者導致胰島素抵抗細胞因子[7]. 一系列的研究發現在血漿和/或組織中的IL-6水平升高會導致胰島素抵抗[8]. 在肥胖和2型糖尿病患者中, IL-6的水平是升高的[9]. 進行減肥手術\\(bariatric surgery\\)的患者血清中IL-6濃度降低, 同時伴隨患者的體質量減輕和胰島素抵抗減輕. 飲食誘導的肥胖小鼠使用IL-6抗體治療后, 胰島素的敏感性明顯增強, 同時血脂可回歸至正常水平. IL-6-/-基因敲除小鼠存在胰島素抵抗, 而且小鼠成年后表現為肥胖體型, 血中膽固醇和甘油三酯水平較高[10]. 而I L-6+/+轉基因小鼠則無胰島素抵抗, 血中膽固醇和甘油三酯水平較低[11]. 以上研究結果提示,IL-6在胰島素抵抗和脂代謝中起重要作用.

I L-6屬于I L-6細胞因子家族, 可由脂肪細胞、免疫細胞和內皮細胞分泌, 可作為肝臟細胞刺激因子, 誘導各種急性期基因的表達. IL-6通過結合IL-6受體后誘導gp130形成同二聚體發揮作用, 但對于細胞內gp130如何發揮作用的機制仍不確切[12,13]. 我們認為, I L-6參與了NAFLD的胰島素抵抗及炎癥反應過程, 但其是如何通過信號通路來影響脂肪肝的發生和發展仍然不明確, 故進行了本項研究. 本研究首次嘗試使用人肝臟L-02細胞進行脂肪肝實驗[14,15],期望通過脂肪肝的細胞模型來進一步研究IL-6可能發揮作用的細胞因子信號通路, 為治療NAFLD提供新的靶點.

NAFLD提供新的靶點.

1 材料和方法

1.1 材料 小牛血清、RPMI 1640培養基\\(Gibco公司\\); 亞油酸\\(sodium oleate\\)、棕櫚酸\\(sodium pal-mitate\\)均購自Sigma aldrich公司; TRIzol\\(Gibco公司\\); 細胞總RNA提取試劑盒\\(上海生工生物技術服務有限公司\\); 實時定量PCR SYBR green PCRmaster mix試劑盒\\(TaKaRa公司\\); 細胞蛋白裂解液\\(RIPA, 上海申能博采\\); 蛋白質含量檢測試劑盒BCA\\(bicinchoninic acid, PIERCE公司\\); 蛋白質轉移用硝酸纖維膜\\(Bio-Rad公司\\); 所有一抗均購自Cell Signaling公司; 所有二抗均購自SantaCruz公司; 蛋白條帶顯色劑ECL\\(Amersham\\);ELISA試劑盒\\(妙通生物公司\\); 蛋白芯片雜交標準流程和試劑盒\\(Full Moon公司\\). 4 ℃離心機\\(預冷Fresco 17, Thermo Scientific, USA\\); 常溫離心機\\(Pico21, Thermo Scientific, USA\\); 酶標儀\\(PE Victor, PE, USA\\); 渦旋振蕩器\\(Vortex 5,QILINBER, China\\); 搖床\\(TS-2, Kylin-Bell LabInstruments, China\\); 芯片小型離心機\\(ChipMatePMC-082, Tomy, Japan\\); 芯片掃描儀\\(GenePix4000B, Axon Instruments, USA\\); 軟件GenePixPro 6.0\\(Axon Inxtruments, USA\\); Rotor Gene Q定量PCR儀\\(Qiagen公司\\).

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及脂肪肝模型構建: 人肝細胞株L-02用含10%小牛血清的RPMI 1640培養基培養\\(37 ℃、50 mL/L CO2\\). 將亞油酸和棕櫚酸分別以3∶0、2∶1、1∶1、1∶2、0∶3作用于培養的細胞, 24 h后, 形成脂肪浸潤的肝臟細胞模型. 應用MTT方法進行脂肪酸的細胞毒性檢測. 使用1 mg/L尼羅紅進行熒光染色, 在熒光顯微鏡下\\(激發光488 nm, 發射光550 nm\\),運用圖像分析系統選擇最佳比例濃度的脂肪肝細胞模型.

1.2.2 細胞因子給藥: IL-1β、IL-6、IL-17α分別作用于細胞, MTT方法檢測細胞毒性發現以上細胞因子對L-02細胞的增殖和凋亡無明顯影響, 故選用常規濃度IL-6: 20 ng/mL、IL-1β: 2 ng/mL、IL-17α: 10 ng/mL作用于細胞.

1.2.3 R N A提取-逆轉錄-實時定量P C R: 應用TRIzol按照細胞總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA. 將隨機引物及RNA模板在70 ℃變性5 min, 加入逆轉錄Buffer、dNTP、RNase抑制劑、MMuLV逆轉錄酶后, 25 ℃溫育10 min,42 ℃反應1 h, 70 ℃滅活10 min, 冰浴5 min, 合成cDNA. 實時定量PCR各實驗組以20 μL為反應體系, 每20 μL反應體系中加入1 μL cDNA. 實驗使用Rotor Gene Q定量PCR儀. 反應采用兩步法進行, 反應條件為: 95 ℃ 2 min熱啟動; 95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s, 共40個循環. 程序設定在每個循環的第二個步驟收集熒光信號, 最后由軟件自動生成熒光動力學曲線圖, 并據此進行相對定量分析.

1.2.4 Western blot: 將細胞離心沉淀后加入裂解液, 蛋白含量用BCA蛋白質檢測試劑盒檢測定量. 蛋白質進行變性聚丙烯酰氨凝膠電泳分離后,轉移至硝酸纖維膜上. 膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h. 一抗于4 ℃雜交過夜, 二抗于室溫雜交1 h, 蛋白條帶用ECL顯色.

1.2.5 ELISA: 在L-02細胞中按上述方法誘導脂肪肝細胞模型, 收集細胞培養液, 以1000 g離心15 min, 收集上清待測. 根據ELISA試劑盒說明書步驟操作, 采用雙抗體夾心ELISA法, 將待測樣本或不同濃度標準品加入包被了細胞因子單抗的酶標板中, 并依次加入生物素化的細胞因子抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素反應,加入顯色底物顯色, 最終加入終止液終止反應,在450 nm處測A值. 以標準物的濃度為橫坐標,A值為縱坐標, 計算出標準曲線的直線回歸方程式, 將樣品的A值代入方程式, 計算出樣品濃度,即為樣品的實際濃度.

1.2.6 蛋白質芯片: 按照提供的雜交標準流程和試劑盒進行芯片雜交、洗滌與檢測. 具體方法如下: 常規裂解蛋白質后, 使用BCA蛋白質檢測試劑盒測定蛋白質濃度; 每樣本取50 μg蛋白, 每管加入3.0 μL Biotin/DMF, 終體積70 μL, 進行蛋白質樣品標記; 芯片封閉; 芯片雜交; 掃描芯片進行檢測.

統計學處理 實驗結果用SPSS17.0軟件進行統計分析, 采用方差分析法比較各組均數之間的差異,P<0.05為差異有統計學意義.

2 結果

2.1 建立L-02細胞脂肪肝細胞模型 MTT試驗發現細胞的死亡率與棕櫚酸的濃度增加而明顯增加, 亞油酸和棕櫚酸以2∶1比率, 混合濃度為1.0 mmol/L時細胞毒力最小, 活力最強. 熒光檢測發現脂肪在肝臟L-02細胞的聚集率為89.2%±5.4%, 而對照組的脂肪聚集率為5.2%±2.6%\\(P<0.05\\)\\(圖1\\).

2.2 IL-1β、IL-6、IL-17α在肝臟L-02脂肪肝細胞模型中的mRNA表達水平 實時定量PCR檢測的結果可以看到, 與未處理對照組相比, 脂肪肝細胞模型組中IL-1β和IL-6的mRNA水平顯著增加,IL-1β升高15.1倍, IL-6升高10.2倍, 而IL-17α表達水平沒有明顯變化, 所以我們推測炎癥因子IL-1β和IL-6在L-02細胞模型脂肪肝的形成中可能發揮作用\\(P<0.05\\)\\(圖2\\).

2.3 IL-1β、IL-6、IL-17α在肝臟L-02細胞脂肪肝模型中的分泌水平 與未處理對照組相比,ELISA結果顯示, L-02細胞在未接受任何刺激時,就存在IL-6的分泌\\(71.8 pg/mL\\), 但模型組細胞分泌量顯著增加\\(1187.8 pg/mL\\)\\(P<0.05\\), 這提示IL-6在L-02細胞脂肪浸潤過程中發揮了重要作用\\(圖3\\). 對于IL-1β和IL-17α, 無論在對照組及脂肪肝細胞模型組的培養液中, ELISA方法都未能檢測到其存在, 提示L-02細胞不分泌這兩種細胞因子, 因此, 雖然模型組IL-1β mRNA水平有顯著增加, 但其可能不被分泌到細胞外, 對于亞油酸和棕櫚酸誘導L-02細胞脂肪肝模型的形成并不發揮重要作用.

2.4 初步檢測IL-1β、IL-6、IL-17α下游信號分子在細胞脂肪肝模型形成前后表達變化 在L-02細胞中按上述方法誘導脂肪肝細胞模型, 同時或單獨給予IL-6\\(或IL-1β、IL-17α\\). 細胞處理分組為: 對照組、模型組\\(SO+SP\\)、單獨給予IL-1β組\\(IL-1β\\)、單獨給予IL-6組\\(IL-6\\)、單獨給予IL-17α組\\(IL-17α\\)、模型組同時給予IL-1β組\\(IL-1β+SO+SP\\)、模型組同時給予IL-6組\\(IL-6+SO+SP\\)及模型組同時給予IL-17α組\\(IL-17α+SO+SP\\). 應用Western blot方法我們初步檢測了各組細胞中細胞因子相關信號通路中胰島素受體底物1\\(insulin receptor substrate 1,IRS-1\\)、Grb2相關結合蛋白2\\(Grb2-associatedbinder 2, Gab2\\)、a-tubulin、磷脂酰肌醇3-激酶\\(phosphoinositide-3-kinase, PI3K\\)、蛋白激酶B\\(protein kinase B, AKT\\)及細胞因子信號抑制因子-3\\(suppressor of cytokine signaling-3, SOCS3\\)等分子的蛋白表達, 如圖4中所示,AKT和SOCS3能夠很好表達, 但各組細胞表達量無明顯差別.

由于其他蛋白分子抗體較弱, 未能得到結果, 因此, 在后續的實驗中利用蛋白質芯片方法進一步檢測, 以明確IL-6細胞因子可能的作用機理.

2.5 蛋白芯片檢測IL-6下游信號通路分子磷酸化水平變化 我們應用蛋白質芯片技術分別檢測了L-02細胞對照組以及脂肪肝模型組中IL-6下游信號通路蛋白分子的磷酸化水平\\(圖5\\). 對芯片結果進行分析, 結果顯示IL-6下游Shc/ERK信號通路\\(Shc, ERK\\), mTOR信號通路\\(p70S6K\\),PI3K/AKT信號通路\\(AKT2\\)均有激活, 而下游NF-κB信號通路可能受到抑制\\(IKKβ\\). 同時, 表1結果顯示已有文獻報道[16-19]過的IL-6能夠引起磷酸化的糖原合成酶激酶-3\\(glycogen synthasekinase-3β, GSK-3β\\)、蛋白激酶Cζ\\(protein kinaseCζ, PKCζ\\)、真核起始因子4E\\(eukaryotic initia-tion factor 4E, eIF4E\\)等分子的磷酸化水平也顯著上調. 這些結果提示L-02細胞脂肪浸潤過程中, IL-6表達量上調并分泌后, 其下游信號通路被廣泛激活.

此外有文獻報道[20,21], IL-6與肝臟胰島素抵抗密切相關, 蛋白芯片的結果也顯示, 胰島素受體IRS-1第307位絲氨酸磷酸化水平上調, 而IRS-1第323位絲氨酸磷酸化下調\\(表1\\), 這提示在L-02細胞脂肪肝模型中胰島素信號通路受到了破壞, 因此IL-6也可能通過影響胰島素信號通路參與細胞脂肪肝模型形成.

3 討論

目前研究[20,21]認為, 胰島素抵抗以及機體慢性炎癥參與NAFLD的形成. 胰島素抵抗可以增加游離脂肪酸\\(free fatty acid, FFA\\)進入肝臟, 而且刺激肝臟脂肪合成中各種酶的活性, 進一步促進脂質沉積, 也可以誘導氧化應激和刺激肝臟星狀細胞增殖分泌細胞外基質促進肝臟纖維化.

而炎癥因子可以參與NAFLD肝臟組織細胞的代謝、炎癥反應、細胞死亡、再生和纖維化.

上述研究我們發現, 在脂肪酸處理的肝臟L-02細胞中, IL-6在細胞內外表達均明顯升高,這說明IL-6在脂代謝中發揮重要的作用. 目前無相關文獻報道IL-17α與NAFLD的關系, 我們研究發現IL-17α在體外肝臟細胞表達無變化, 因此IL-17α可能不參與NAFLD形成的機制. 我們研究還發現IL-1β在體外肝臟細胞內mRNA水平表達顯著升高, 但是在細胞外并無分泌表達. 然而一些體內研究[22]發現, 人血漿高IL-1β水平可以預測2型糖尿病發生, 合并IL-6升高時更有價值.

脂肪組織中IL-6水平約是血漿中的100倍, 還可以分泌高水平的IL-1β, 誘導炎癥反應. 在小鼠脂肪細胞中, 延長IL-1β治療可以減少胰島素誘導的葡萄糖攝取[23]. 應用IL-1β受體拮抗劑可以增加脂肪細胞胰島素敏感性, 致AKT磷酸化的水平增加[24]. 因此, 我們推測, IL-1β在體內可能由脂肪等其他組織自分泌和旁分泌產生, 從而對機體NAFLD的形成發揮作用.

I L-6和其受體結合后需要激活一個含130kDa的信號轉導分子gp130才能發揮作用[25]. 與gp130作用后, 低親和力的IL-6結合位點轉變為高親和力的位點. gp130是IL-6家族分子共享的細胞信號轉導受體, 目前研究發現其主要的路徑有: \\(1\\)活化酪氨酸激酶\\(janus activated kinase,JAK\\), 通過STAT3\\(signal transducers and activa-tors of transcription 3\\)/SOCS3的酪氨酸磷酸化轉導進入核內; \\(2\\)激活Ras-MAP\\(ras-mitogen-activated protein\\)激酶路徑, 通過腺苷酸活化蛋白激酶\\(AMP-activated protein kinase, AMPK\\)活化而進入細胞核內, 作用于核內底物NF-IL-6[26].

Giordano等[27]報道, IL-6與gp130結合后還可以激活有絲分裂原蛋白激酶ERK-1和-2\\(細胞外信號調節酶\\). 而活化ERK-1和ERK-2需要Src形成Shc-Src同源體. Pelosi等[28]報道在體外肌纖維細胞中IL-6可以通過下調mTOR/p70S6K來影響細胞分化. Chew等[29]報道IL-6通過STAT1和STAT3磷酸化結合至PPARα啟動子而抑制PPARα轉錄, 來調節JAK2/STAT1-3和PI3K/AKT/mTOR通路. 我們研究亦發現IL-6下游Shc/ERK信號通路\\(Shc, ERK\\)、mTOR信號通路\\(p70S6K\\)和PI3K/AKT信號通路\\(AKT2\\)均有激活, 而下游NF-κB信號通路可能受到抑制\\(IKKβ\\). 此外, 有文獻報道[16-19]IL-6能夠引起磷酸化的GSK3β、PKCζ、eIF4E等分子的磷酸化水平也顯著上調. 這些結果提示L-02細胞脂肪浸潤過程中, IL-6表達量上調并分泌后, 其下游信號通路被廣泛激活.

已有文獻報道[20,21], IL-6與肝臟胰島素抵抗密切相關, 蛋白芯片的結果也顯示, 胰島素受體IRS-1第307位絲氨酸磷酸化水平上調, 而IRS-1第323位絲氨酸磷酸化下調, 這提示在L-02細胞脂肪肝模型中胰島素信號通路受到了破壞, 因此IL-6也可能通過影響胰島素信號通路參與細胞脂肪肝模型形成.

直接干預IL-6/gp130信號通路是未來治療疾病的靶目標, 目前已經在尋找sgp130Fc應用于臨床試驗治療炎癥性疾病[30]. 由于時間精力的限制, 雖然在本實驗中發現多個信號通路中蛋白被激活, 但是未能進行進一步驗證, 這將在今后實驗中繼續進行, 以希望找到合適的蛋白靶點應用于治療NAFLD.