免疫組織化學技術\\(免疫組化\\)是一種在臨床病理診斷和生物醫學研究中應用非常廣泛的技術。
自 Coons 等成功應用免疫熒光方法以來，免疫組化經過不斷改良，建立了多種簡便、靈敏的方法?，F今臨床病理中主要應用親和素 － 生物素\\(ABC\\)法進行診斷，但 ABC 法存在著背景深、靈敏度相對較弱等不足。本研究對 EnVision 法和 ABC 法進行比較，分析 2 種方法各自的優缺點，為臨床病理檢測提供更合適的方法。
1 資料與方法
1． 1 資料 選取 2012 年 1 月 － 2014 年 1 月確診 10例腎母細胞瘤的腎組織標本和 7 例濾泡性惡性淋巴瘤的淋巴結組織標本。所有標本均來自于中山大學第一附屬醫院病理科。
1． 2 試劑 WT1 抗體\\( 批號:14012677C\\) 來自于福州邁新生物技術開發有限公司\\(中國\\);CD10 抗體\\(批號:D06828\\)、Bcl － 6 抗體\\(批號:1225504C\\)來自于羅氏公司\\(美國\\); ABC 試劑盒\\(批號:20001418\\)、EnVisionTMFLEX + Ｒb \\( LINKEＲ \\) 試劑 盒 \\( 批號:20008198\\)和 DAB 顯色試劑盒\\(批號:20008206\\)來自于 DAKO 公司\\(丹麥\\);其他試劑自配。
1． 3 方法 所有組織標本均為石蠟標本，每個石蠟標本連續切片，厚度 3 μm ～ 5 μm，分別制成 2 張玻片，將其分成 2 組\\(ABC 組和 EnVision 組\\)分別染色。
ABC 組經脫蠟、水化、修復等常規步驟后，用 WT1 抗體\\(1∶100\\)、CD10 抗體\\(1∶200\\)和 Bcl －6\\(1∶100\\)抗體孵育 1 h 后，直接用 HＲP － 復合物孵育 1 h，然后DAB 顯色，蘇木精染核，封片。EnVision 組在一抗孵育之前的步驟與 ABC 組相同，在 WT1 抗體、CD10 抗體或 Bcl － 6 抗體孵育后，用 EnVisionTMFLEX + Ｒb\\(LINKEＲ\\) 孵育 20 min，再用 HＲP － 復合物孵育40 min，然后 DAB 顯色，蘇木精染核，封片。所有染色后的玻片均通過 OLYMPUS 光學顯微鏡進行觀察，應用相應的拍攝系統拍照后，進行數據分析。
2 結 果
2． 1 2 種方法染色過程的比較 EnVision 法染色的前處理與 ABC 法相同，應用二甲苯脫蠟，所用抗原修復液的種類、時間均一致，封閉劑都采用 3% H2O2。
EnVision 法染色所用一抗孵育時間為 30 min，較 ABC法縮短一半;二抗孵育中，EnVision 法需要前后經 En-VisionTMFLEX + Ｒb \\(LINKEＲ\\)和多聚體復合物 2 步，共需 60 min，而 ABC 法只需 1 步，時間也為 60 min。
DAB 顯色、蘇木精染核等步驟，2 種方法也均一致\\(表 1\\)。所以，EnVision 法比 ABC 法染色時間縮短30 min?！颈?】
2． 2 WT1 在腎母細胞瘤中的表達 2 種方法檢測出WT1 抗體表達差異較大。顯微鏡下觀察，EnVision 組WT1 陽性表達的細胞呈深棕 色，染 色 背 景 清 晰\\(圖 1A\\);ABC 組 WT1 陽/陰性表達的細胞著色對比度不大，細胞多呈淺藍色，部分細胞呈深灰藍色，背景較清晰\\(圖 1B\\)。2． 3 CD10 在濾泡性惡性淋巴瘤中的表達 2 組染色均能夠檢測出 CD10 抗體表達，陽性細胞呈深棕色，陰性細胞不著色。EnVision 法染色的背景清晰，陰/陽性細胞著色對比度大，易于區分，不存在非特異著色\\(圖 2A\\)，但 ABC 法染色的背景不清晰，整體呈彌漫著色，且有部分細胞非特異著色\\(圖 2B\\)。2． 4 BCL － 6 在濾泡性惡性淋巴瘤中的表達 2 種染色均能夠檢測出 Bcl － 6 抗體表達，Bcl － 6 抗體陽性細胞呈深棕色，陰性不著色，但表達量區別較大。En-Vision 法檢測 7 例濾泡性惡性淋巴瘤中 Bcl － 6 陽性表達細胞都在 80% 以上，而 ABC 組檢測 7 例濾泡性惡性淋巴瘤中 Bcl － 6 陽性表達細胞均不超過 20%\\(圖 3\\)。3 討 論免疫組化方法是利用已知的抗體與抗原之間的特異性結合來鑒定組織和細胞內的某種物質的性質，利用過氧化物酶、堿性磷酸酶等作用于底物產生的顏色反應示蹤的一種技術。免疫組化從最初的熒光素標記法到后來的酶標記法，經歷了幾十年的時間，已發展有 S － P 法、ABC 法、PAP 法及 EnVision 法等。
EnVision 法，又稱多聚螯合物酶法，主要是在一個多聚體復合物上連接多個二抗和酶\\(HＲP 或 AP\\)，以增強檢測的敏感度，由于此多聚體復合物的分子量大，穿透性較差，所以多應用在石蠟切片免疫組化染色中。有研究報道，此方法較 SP 法、LSAB 法等敏感度提高約 30 倍 ～ 40 倍。本研究主要是應用臨床上最常用的石蠟標本為材料，以檢測 EnVision法在常規病理中的應用價值，同時避免其受穿透性的影響。
不同抗體檢測中 EnVision 法都能達到較理想的效果。相對 ABC 法，EnVision 法增加一個染色步驟，縮短了免疫組化的時間。EnVision法能夠檢測出腎母細胞瘤中 WT1 抗原的表達，陽性細胞呈深棕色，背景清晰;但 ABC 法未能夠明確檢測出 WT1 抗原的表達，染色后陰/陽性表達細胞對比度不強，僅有部分細胞呈深灰藍色。EnVision 法與 ABC 法都能夠檢測出濾泡性惡性淋巴瘤中 CD10、Bcl － 6 抗原的表達。
ABC 法染色 CD10 表達區域呈彌漫性分布，有非特異性著色;EnVision 法檢測 CD10 表達清晰，無非特異著色。EnVision 法檢測 Bcl － 6 表達含量高達 80% 以上，而 ABC 法檢測 Bcl － 6 表達含量僅在 20% 以下。
聯合 CD10、Bcl －2 等多種抗體的免疫組化結果，確定EnVision 法檢測的更為準確，ABC 法未能檢測出大部分 Bcl －6 抗原的表達。
同時，還對比觀察了 EnVision 法和 ABC 法檢測Actin、CK、CD3 等 30 種常用抗體的效果。EnVision 法染色的背景無明顯著色，敏感度高，非特異性著色少。
對于 CD31、α － SMA、Vimentin 等抗原表達強的抗體，ABC 法與 EnVision 法染色效果均較好;對于 Bcl － 6、CgA、WT1 等抗原表達弱的抗體，EnVision 法較 ABC法染色效果顯著提高。
綜上所述，本文認為，EnVision 法是一種敏感度高、特異性強、背景低、染色快速、操作簡便的免疫組化方法，應該在臨床病理檢測中推廣應用。
