盡管各種治療手段的改進,缺血性心臟病仍是目前全球致死性疾病的首要病因。缺血預處理\\(IPC\\)被公認為有效的心肌保護方式,但IPC必須在缺血前應用,因此臨床應用受到限制。研究人員發現缺血后處理可以通過減小缺血心肌梗死面積,提高血管內皮細胞功能等途徑發揮心肌保護功能。
而且缺血后處理不受時間的限制,已有研究人員證實缺血后處理可以在經皮冠狀 動 脈 介 入 術 中 使用。然而缺血后處理的分子機制仍然不清楚。
目前多數研究使用乳鼠心肌細胞或者新生鼠心肌細胞缺氧復氧模型。新生鼠心肌細胞與成年鼠心肌細胞在形態、結構和功能上存在很大差異,很難將新生期心肌細胞培養所得的研究結論應用到完全分化的成熟心肌細胞中。且成年心肌細胞更有科學研究價值。故本實驗采用成年大鼠心肌細胞缺氧復氧模型探討缺氧后處理的心肌保護機制。
1 材料與方法
1.1 動物SD大鼠,雄性,體質量250~350g,由重慶第三軍醫大學實驗動物中心提供[SCXK\\(渝\\)2012-0005]。
1.2 主要藥品、試劑及儀器硫氫化鈉\\(Sigma,美國\\);M199培 養 基 \\(Thermo,美 國\\);層 粘 連 蛋 白\\(Sigma,美國\\);Ⅱ型膠原酶\\(Sigma,美國\\);磷酸化p38MAPK一 抗、b-actin以 及 相 應 的 二 抗 \\(SantaCruz,美國\\);線粒體膜電位檢測試劑盒\\(JC-1\\)\\(碧云天生物技術研究所,江蘇\\);ALC-HP型離體心臟灌流實驗裝置\\(奧爾科特生物科技有限公司,中國\\);DIG-303A型艾柯超純水器 \\(成都唐氏康寧科技發展有限公司,中國\\);激光共聚焦顯微鏡 \\(Leica,德國\\);95%O2+5%CO2細胞培養箱 \\(Thermo,美國\\);95%N2+5%CO2細 胞 培 養 箱 \\(Thermo,美國\\);Petri皿 \\(杭州生友生物技術有限公司,中國\\);其他試劑均為國產分析純。
1.3 心肌細胞的分離培養腹腔注射異戊巴比妥40mg/kg,肝素250μg/kg麻醉后迅速劍突下剖胸取出心臟,應用langendorff離體灌注裝置,依次逆行灌注750μm Ca2+液,無Ca2+EGTA液,Ⅱ型膠原酶液;之后將消化好的心臟浸泡于5mL含1%的Ⅱ型膠原酶液中,并置于37℃恒溫水浴搖床上震蕩5min/次,160μm無菌濾網過濾收集酶液于無菌試管內,置于37 ℃恒溫水槽內等待心肌細胞自然沉降,重復操作5次;酶洗脫洗滌沉降細胞3~4次,M199培養基洗滌細胞2次,收集細胞;將細胞數以104/cm2的密度平鋪于層粘連蛋白預處理的Petri皿中,加入培養基放入95%O2+5%CO2細胞培養箱。
1.4 實驗分組將每次分離培養的細胞隨機分為3組:正常組\\(NOR\\)、缺氧復氧組\\(H/R\\)、缺氧后處理組\\(HP\\)。NOR組細胞持續在95%O2+5%CO2細胞培養箱中培養6h;H/R組正常培養4h后換上缺氧培養基\\(臨用前99.9%高純氮氣飽和1h,并測血氣氧分壓<60mmHg\\)置于缺氧培養箱中1h后,再次正常培養1h;HP組于再次正常培養前進行復氧3min/缺氧3min,重復3次;余操作與H/R組相同。
1.5 檢測指標
1.5.1 心肌細胞線粒體膜電位檢測分組處理結束后,吸除培養基,加入1mL的細胞培養液及1mLJC-1染色工作液,孵育20min,激光共聚焦顯微鏡下觀察。檢測JC-1單體時激發光為490nm,發射光為530nm,產生綠色熒光;檢測JC-1聚合物時,把激發光設置為525nm,發射光為590nm,產生紅色熒光。紅綠熒光的比值為線粒體膜電位的高低。
由不知分組情況的實驗人員隨機選擇8個不同視野觀察30個細胞。
1.5.2 Western blot檢測p38絲裂原活化蛋白激酶\\(p-p38MAPK\\)表達量各組加入去污裂解液裂解細胞,提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,取50g總蛋白,加等量緩沖液,將電泳分離后的蛋白電轉至PDVF膜 上,經 封 閉、洗 脫 后 加 入 磷 酸 化p-p38MAPK一抗,孵育過夜,加入相應的熒光二抗,避光孵育1h,掃描PDVF膜。分析軟件檢測各組p-p38MAPK條帶積分光密度值與β-actin條帶積分光密度值,兩者的比值反映蛋白表達水平。
1.5.3 心肌細胞內鈣離子濃度各組培養基加入2mL Flou-3AM\\(5μL/mol\\)負載30min。吸除培養基,用磷酸鹽緩沖液洗滌3遍后,吸除液體,上鏡檢測。由不知分組情況的實驗人員隨機選擇8個不同視野觀察30個細胞內鈣離子熒光強度。
1.6 統計學方法采用SPSS 17.0統計分析軟件處理。計量資料數據以均數標準差\\(x珚±s\\)表示。各組間采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 缺氧后處理對心肌細胞線粒體膜電位\\(MMP\\)的影響與正常組比較,H/R組和HP組MMP顯著降低\\(P<0.05\\);HP組MMP明顯高于H/R組\\(P>0.05\\),見圖1,見表1。
2.2 缺氧后處理對心肌細胞鈣離子濃度的影響與正常組和HP組比較,H/R組鈣離子濃度顯著升高\\(P<0.01\\);HP組和正常組間差異無統計學意義\\(P>0.05\\),見圖2,表1。
2.3 缺氧后處理對心肌細胞p-p38MAPK表達量的影響與正常組和HP組比較,H/R組p-p38MAPK表達量顯著升高\\(P<0.05\\);HP組和正常組間表達量差異無統計學意義\\(P>0.05\\),見表1?！颈?】
3 討論
1994年Gottlieb等從形態學和生物化學方面證實,缺血再灌注心肌中存有凋亡細胞。目前認為細胞凋亡對于缺血再灌注損傷\\(IRI\\)具有十分重要的意義,是心肌IRI心肌細胞死亡的重要方式之一,細胞凋亡數目的多少決定了IRI的嚴重程度。
故抑制細胞凋亡是抗IRI的一個重要手段。
現已明確線粒體參與了細胞凋亡過程,起著主開關作用。
MMP對于維持線粒體的正常功能是必要的。研究表明幾乎所有的誘導劑誘發不同類型的細胞凋亡過程中,均出現MMP下降,且發生于細胞形態學改變之前。因此MMP下降是細胞凋亡早期的標志,一旦MMP耗損,細胞就會進入不可逆凋亡過程。如抑制MMP下降,則可能阻抑細胞凋亡的發生。本實驗結果提示缺氧復氧導致MMP下降,缺氧后處理可以減輕這種改變。說明缺氧后處理可以通過抑制細胞凋亡發揮細胞保護作用。
大量的研究證實機體組織在缺氧時都會出現細胞內鈣超載,這與本實驗結果相符。
Ca2+超載是細胞缺氧的結果,而鈣超載參與了核酸內切酶、需鈣蛋白酶、谷氨酰胺轉移酶等得激活,是啟動細胞凋亡的關鍵因素。因此細胞內鈣超載又是引起缺氧組織細胞凋亡的重要原因。目前有學者認為Ca2+的濃度變化是導致缺氧組織細胞凋亡的最后通路。因此細胞內Ca2+穩態的維持對于細胞生命活動是至關重要的。本實驗結果提示缺氧后處理通過維持細胞內Ca2+穩態發揮心肌保護作用。
缺氧使線粒體功能受損,三磷酸腺苷\\(ATP\\)生成減少,致使肌膜及肌漿網膜鈣泵功能障礙,不能排出和攝取細胞漿中多過的鈣,造成包漿鈣超載。研究表明當細胞質內Ca2+濃度低于0.2μmol/L時,線粒體通透性轉換孔處于失活狀態,而當細胞內Ca2+濃度升高時,高濃度的Ca2+能夠誘導線粒體通透性轉換孔開放。因此線粒體損傷和細胞內鈣超載互為因果關系,本實驗結果提示缺氧后處理可以同時保護線粒體和抑制鈣超載,阻斷惡性循環,發揮細胞保護作用。
p38MAPK是MAPK家族重要成員之一,可調控細胞增殖、分化、凋亡等。在心臟,p38具有雙向功能。研究人員發現把IR心肌暴露于含氧量高的環 境,心 肌 功 能 障 礙 和 梗 死 面 積 大 大 減 輕,p38MAPK大量磷酸化,提示p-p38MAPK的心肌保護作用。然而有學者認為黃芩素可以通過抑制線粒體凋亡途徑和p38MAPK通路來發揮細胞保護作用。本實驗結果提示缺氧復氧損傷導致心肌細胞內p-p38MAPK表達量增高,缺氧后處理抑制此種反應。這種結果的差異可能與p38MAPK的異構體以及不同的保護方式有關。p38α,β在心臟中表達豐富,而γ,δ不表達于心臟。p38α缺氧和缺血時表達量增高,p38β抑制自由基形成進而抑制細胞凋亡。此試驗結果中缺氧后處理抑制p38表達升高是否與p38異構體不同表達量有關需要進一步實驗證實。
綜上所述,缺氧后處理可對缺氧/復氧心肌細胞產生保護作用,其機制可能與下調p-p38MAPK表達量,抑制線粒體膜電位下降以及鈣超載進而抑制心肌細胞凋亡有關。
