非酒精性脂肪肝\\(non-alcoholicfattyliverdisease，NAFLD\\)包括了肝臟損傷的一個廣泛的疾病譜。從單純性脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎\\(non-alcoholicsteatohepatitis，NASH\\)，隨后可進展為肝硬化和終末期肝病。其中NASH作為NAFLD中的關鍵階段，研究其發病機制對NAFLD的治療起著相當重要的作用。

現已有研究證實NAFLD中甘油三酯和游離脂肪酸的代謝失調機制，但膽固醇在炎癥狀態下參與“第二次打擊”，形成NAFLD的機制仍不清楚。本實驗利用四氯化碳\\(carbontetrachloride，CCl4\\)的趨肝毒性使小鼠肝細胞發生內質網應激，使固醇調節元件結合蛋白\\(sterolregulatorybindingproteins，SＲEBPs\\)表達增加，導致肝細胞內脂質集聚，出現肝細胞的脂肪變性，實現“第一次打擊”，再用酪蛋白誘發慢性低豐度炎癥的產生，探討炎癥因子作為一個獨立的危險因素在肝細胞脂肪變性的基礎上發揮“第二次打擊”形成脂肪肝的分子機制。

1 材料與方法

1．1 實驗動物

6～8周齡C57BL/6J雄性小鼠\\(購自重慶醫科大學實驗動物中心\\)12只，體質量20～26g，許可證號:SCXK2012-0001，重慶醫科大學實驗動物中心SPF室飼養。采用隨機數字表法將小鼠分為2組。對照組\\(n=6\\):隔天皮下注射質量分數40%的CCl4-植物油溶液\\(0．3mL/100g\\)2周后，再隔天皮下注射生理鹽水0．5mL16周;炎癥組\\(n=6\\):隔天皮下注射質量分數40%的CCl4-植物油溶液\\(0．3mL/100g\\)2周后，再隔天皮下注射10%酪蛋白\\(casein\\)0．5mL16周。實驗結束后，留取小鼠血清和肝臟組織，－80℃保存。

1．2 血清中炎癥因子測定

淀粉樣蛋白\\(serumamyloidA，SAA\\)和腫瘤壞死因子-α\\(tumornecrosisfactor-α，TNF-α\\)的濃度使用ELISA試劑盒檢測\\(分別購自美國Ｒ＆D公司及欣博盛生物科技有限公司\\)。

1．3 血清脂質含量測定

小鼠血清中總膽固醇\\(totalcholesterol，TC\\)、低密度脂蛋白膽固醇\\(low-densitylipoproteincholesterol，LDL-c\\)和高密度脂蛋白膽固醇\\(high-densitylipoproteincholesterol，HDL-c\\)濃度采用酶偶聯比色法檢測\\(試劑盒購自重慶百杰生物技術公司\\)。

1．4 肝臟HE染色及油紅O染色

取部分新鮮肝組織用4%多聚甲醛固定，分別制作石蠟切片及冰凍切片。石蠟切片用二甲苯脫蠟后梯度酒精脫水，蘇木精染色8min，蒸餾水沖洗多余染液，伊紅染色2min，95%酒精脫水5min，二甲苯透明5min，中性樹膠封片。冰凍切片用10%福爾馬林鹽溶液固定30min，1，2-丙二醇孵育2min后，油紅O\\(Sigma公司\\)染色10～15min，蘇木精復染1min，流水沖洗返藍10min，甘油封片。再分別在顯微鏡下觀察肝組織脂肪病變程度。

1．5 實時熒光定量

PCＲ采用Trizol法提取肝組織總ＲNA，用DEPC水稀釋后測定濃度及D\\(260\\)/D\\(280\\)值\\(正常值為1．8～2．0\\)，標化到相同濃度。按照逆轉錄試劑盒\\(TaKaＲa\\)操作說明將總ＲNA逆轉錄成cDNA。采用SYBＲGreen熒光定量ＲT-PCＲ檢測肝組織的低密度脂蛋白受體\\(low-densitylipoproteinreceptor，LDLr\\)、固醇調節元件結合蛋白-2\\(sterolregulatoryelementbindingprotein2，SＲEBP-2\\)、SＲEBP裂解激活蛋白\\(SＲEBPcleavageactivatingprotein，SCAP\\)的mＲNACt值，引物序列見表1。取2μL逆轉錄產物進行實時熒光定量PCＲ，以β-actin作為內參照，反應體系為20μL。擴增條件:95℃30s預變性，95℃5s，58℃30s，70℃1min，共40個循環。采用相對定量ΔΔCt計算2組小鼠基因表達的差異，計算公式如下:實驗組相對于對照組基因表達水平的倍數=－exp\\(ΔΔCt\\)，其中ΔΔCt=實驗組ΔCt－對照組ΔCt，ΔCt=目的基因Ct值－內參基因Ct值。

1．6 免疫組織

化學染色肝組織固定后石蠟包埋切片，兔抗LDLr一抗\\(1∶200，北京博奧森\\)，兔抗SＲEBP-2一抗\\(1∶300，北京博奧森\\)，兔抗SCAP一抗\\(1∶250，北京博奧森\\)4℃孵育過夜，用即用型免疫組化試劑盒\\(北京中杉金橋\\)進行染色，具體步驟詳見說明書。DAB染色后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察照相，肝細胞中棕黃色顆粒分布為陽性表達。


1．7 Westernblot檢測

蛋白表達按蛋白提取試劑盒說明提取小鼠肝組織總蛋白，用BCA法進行蛋白定量并標化，每孔蛋白上樣量為80～100μg，β-actin作為內參照蛋白。樣品加變性緩沖液煮沸10min。SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2h，分別加入一抗SＲEBP-2\\(1∶500，北京博奧森\\)、一抗LDLr\\(1∶200，北京博奧森\\)，一抗SCAP\\(1∶500，北京博奧森\\)，一抗β-actin\\(1∶5000，北京中杉金橋\\)，4℃過夜孵育，TBST漂洗10min×3次，加入辣根過氧化物酶\\(HＲP\\)標記的二抗\\(聯科生物技術有限公司\\)，37℃孵育2h，TBST漂洗10min×3次，ECL光化學法進行顯色。

1．8 統計學分析

采用SPSS17．0統計軟件，所有結果以x珋±s表示，2組間結果行獨立樣本t檢驗。

2 結果

2．1 炎癥因子檢測結果

炎癥組的SAA［\\(236．09±38．45\\)ng/mL］和TNF-α［\\(82.59±11．48\\)pg/mL］明顯高于對照組［分別為\\(35．68±11．34\\)ng/mL，\\(17．91±2．77\\)pg/mL，P＜0．05］。

2．2 血清脂質水平檢測結果

炎癥組的HDL-c［\\(0．91±0．10\\)mmol/L］、LDL-c［\\(2．65±0．44\\)mmol/L］、TC［\\(3．69±0．26\\)mmol/L］的血清濃度相對于對照組明顯降低［分別為\\(1．80±0．12\\)、\\(5．76±0．33\\)、\\(4．16±0.22\\)mmol/L，P＜0．05］。

2．3 肝臟HE染色結果

由圖1可以看出，對照組肝細胞的細胞核清晰，索狀排列，呈放射狀分布在中央靜脈周圍。炎癥組肝索結構破壞，肝細胞排列紊亂，可見大量脂滴空泡和炎癥細胞浸潤。每組取3個肝組織切片，每張切片取3個典型視野，根據NAFLD活動度\\(NAFLDactivityscore，NAS\\)評分，對照組評分＜3分，為正常肝細胞形態，而炎癥組NAS評分＞4分，可診斷為NASH。

2．4 小鼠肝細胞油紅O染色結果



圖2顯示對照組可見點或片狀紅染顆粒，炎癥組可見大量紅染顆粒積聚成片，提示炎癥可加重CCl4處理后脂肪變性肝細胞的脂質集聚。

2．5 小鼠肝組織LDLr、SＲEBP-2、SCAP的mＲNA表達實時熒光定量PCＲ檢測結果顯示，炎癥組相對于對照組的LDLr、SＲEBP-2、SCAP基因的表達明顯升高\\(P＜0．05，圖3\\)。



2．6 肝組織免疫組化染色結果

SＲEBP-2、SCAP蛋白表達于肝細胞的胞質中，LDLr蛋白表達于肝細胞的胞膜與胞質?？乖栃员磉_為棕黃色顆粒樣著色。從圖4可看出，炎癥組的LDLr、SＲEBP-2、SCAP的表達比對照組增多。


2．7 Westernblot檢測結果

Westernblot檢測結果顯示，與對照組相比，炎癥組LDLr、SＲEBP-2、SCAP蛋白表達明顯增高，與mＲNA檢測結果相符\\(圖5\\)。




3 討論

NASH作為NAFLD發展的一個關鍵點，其發病機制復雜，目前被人們所接受的是“二次打擊學說”。近年來關于NAFLD甘油三酯和游離脂肪酸的代謝失調機制已有大量報道，但關于膽固醇的代謝失調機制研究較少。

現有的研究發現，機體維持膽固醇穩態平衡的代謝過程由以下3個方面進行調控:通過LDLr攝取適量膽固醇，并通過3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶\\(3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzymeAreductase，HMGCＲ\\)調節膽固醇的內源性合成，而過多的膽固醇則通過三磷酸腺苷結合盒轉運體A1、G1轉到細胞之外。其中機體通過LDLr攝入血漿膽固醇是細胞內膽固醇的主要來源。本研究通過動物體內實驗證明肝細胞經“二次打擊”形成嚴重脂肪肝的膽固醇代謝失調機制。采用CCl4激發肝細胞膜脂質過氧化反應，引發內質網應激，內質網應激時，膽固醇被消耗，從而激活SＲEBPs，它與SCAP結合形成復合物從內質網轉移到高爾基體，在兩個蛋白酶\\(S1P、S2P\\)的作用下，SＲEBPs被裂解，其具有轉錄活性的N-末端片段進入細胞核內，促進LDLr基因及其他生脂相關酶等靶基因的誘導表達，增加肝細胞膽固醇的集聚，破壞正常的LDLr-SCAP-SＲEBP-2反饋調節，即“第一次打擊”;再進行酪蛋白皮下注射，使單純性脂肪變性的小鼠處于持續性低豐度炎癥狀態，引起細胞表面的脂蛋白受體失調，細胞通過LDLr異常大量地攝取血液循環中的膽固醇，膽固醇逆轉運減少，導致肝細胞內膽固醇大量集聚，實現對肝細胞的“第二次打擊”，使肝細胞由單純性脂肪變性轉化為嚴重的脂肪肝。

本研究中C57BL/6J小鼠經2周CCl4注射后再經16周的酪蛋白注射處理，炎癥組的SAA及TNF-α濃度比對照組明顯升高\\(P＜0．05\\)，說明小鼠慢性系統性炎癥模型構建成功。HE染色及油紅O染色中，炎癥組可見大量的脂肪空泡及紅染顆粒，提示炎癥可促進小鼠肝細胞中的脂質集聚。炎癥組小鼠血清中的HDL-c、LDL-c、TC含量較對照組明顯降低\\(P＜0．05\\)，說明炎癥可促進肝細胞通過LDLr異常大量地攝取血液中的膽固醇酯，促進肝細胞內的脂質集聚。ＲT-PCＲ檢測結果顯示炎癥組的LDLr、SCAP、SＲEBP-2的mＲNA表達較對照組分別升高了1．87、5．24、2．39倍，且免疫組化及Westernblot都可看出炎癥組這3種基因的蛋白表達較對照組明顯升高，與基因表達趨勢一致，結果表明炎癥因子可能通過促進LDLr-SＲEBP-2-SCAP的表達加強肝細胞膽固醇的異常攝入，導致肝細胞脂質的異常集聚。

綜上所述，本研究將CCl4導致的肝細胞脂肪變性與控制脂質代謝的SＲEBPs聯系起來，通過體內實驗證實了炎癥微環境對CCl4導致的單純性脂肪變進行了“第二次打擊”，干擾SCAP-SＲEBP2-LDLr的正常反饋調節，促使肝細胞異常大量地攝取膽固醇，闡述炎癥因子在脂肪肝形成過程中的重要作用，為脂肪肝抗炎治療的必要性提供理論依據，同時也為NAFLD治療的新藥開發提供線索途徑，但NAFLD膽固醇酯異常集聚的機制復雜，對引起其代謝失衡的其他通路還有待進一步研究。