阿爾茨海默?。?Alzheimer's disease,AD） 是一種多發于老年人，病理改變主要發生在大腦皮質和海馬，以 β 淀粉樣蛋白（ β-amyloid peptide,Aβ） 沉積形成老年斑、神經原纖維纏結（ neurofibrillary tangles,NFT） 、神經元丟失為主要病理特征。目前普遍認同AD 的主要發病機制： 具有神經毒性的 Aβ 在腦實質沉積，啟動病理級聯反應，形成 NFT,導致廣泛的神經元丟失.Aβ 是由39 ~43 個氨基酸構成，其中，Aβ1-42 肽具有較高聚集傾向，是老年斑中最主要的淀粉樣物質,而且，Aβ1-42 可能參與了突觸改變、細胞凋亡以及由輕度認知功能障礙發展到 AD的進程.目前，轉基因 AD 動物模型是研究 AD的一大熱點，但該模型缺少衰老過程，不能完全復制人類 AD 的所有特征，而且操作技術復雜，費用昂貴，因此還不能廣泛應用。該研究模擬 Aβ 沉積，將Aβ1-42 少量多次灌注于大鼠側腦室制備 AD 模型，利用 Morris 水迷宮法觀察大鼠學習記憶能力的改變，用 RT-PCR 法和 Western blot 法檢測大鼠皮質Bcl-2、Caspase-3 的 mRNA 表達以及 Bcl-2 蛋白表達、Caspase-3 活性。
1 材料與方法
1. 1 材料
1. 1. 1 實驗動物 健康雄性 SD 大鼠 65 只，SPF級，250 ~300 g,2 ~3 月齡，由桂林醫學院實驗動物中心提供。
1. 1. 2 試劑 Aβ1-42 和六氟異丙醇（ 美國 Sigma公司） ; mRNA 提取試劑盒和 PCR 反應體系（ 北京艾德萊公司） ; 逆轉錄試劑盒和引物（ Invitrogen 公司） ;DNA Marker（ 廣州東盛生物科技有限公司） ; WIP 組織裂解液（ 北京博奧森公司） ; BCA 蛋白濃度測定試劑盒（ 碧云天公司） ; 兔抗 Caspase-3（ Active） 一抗（ 上海藍基公司） ; 兔抗 Bcl-2 一抗 （ 武漢博士德公司） ; 鼠抗 β-actin 一抗、山羊抗小鼠 IgG 二抗、山羊抗兔 IgG 二抗、ECL 發光液（ 北京中杉金橋公司） ;PageRulerTM預染蛋白梯度（ 上海麥約爾公司） ; 微量給藥系統（ 深圳瑞沃德公司） ; 實驗所需的儀器由桂林醫學院科學實驗中心和解剖教研室提供。
1. 2 方法
1. 2. 1 Aβ1-42 寡聚體和 Aβ1-42 纖維的制備 ①Aβ1-42 寡聚體制備： 將 1 mg Aβ1-42 單體溶于六氟異丙醇至濃度為 4. 5 mg/ml,室溫孵育 60 min,真空冷凍蒸發六氟異丙醇后，加入二甲基亞砜至濃度為22. 5 mg / ml,超聲浴處理 10 min,加入含有 0. 2%SDS 的 PBS,稀釋濃度至 2. 5 mg / ml,4 ℃ 孵育 24 h后，用 PBS 稀釋至終濃度 1 mg/ml,4 ℃ 孵育 2 周。② Aβ1-42 纖維的制備： Aβ1-42 溶于 PBS 中，濃度為 1 mg/ml,37 ℃ 孵育 7 d,轉變為聚集態的 Aβ1-42,4 ℃ 保存。
1. 2. 2 AD 動物模型的制備 通過 Morris 水迷宮試驗，將逃避潛伏期少于 60 s 的健康雄性 SD 大鼠 60只隨機分成 4 組（ n = 15） : 正常組、PBS 對照組、Aβ1-42 纖維組、Aβ1-42 寡聚體組。用 10% 水合氯醛（ 300 ~350 mg/kg） 腹腔注射麻醉大鼠，頭頂部備皮。將大鼠頭部固定于腦立體定位儀上，手術區消毒，在顱頂中間部作一縱切口，暴露顱骨，參照《大鼠腦立體定位圖譜》，前囟后 0. 8 mm,中線旁開 1. 5mm,用牙科鉆鉆開顱骨，垂直插入微量給藥導管（ 長度 3. 5 mm） ,用牙托粉和義齒基托樹膠將給藥導管固定于顱骨表面，縫合皮膚，肌肉注射青霉素 8萬單位/只，預防感染。通過微量注射內管，每天給予 Aβ1-42 纖維或 Aβ1-42 寡聚體 5 μg,連續給藥 5d.PBS 對照組采用同樣的方法給予等量的 PBS,正常組不作任何處理。
1. 2. 3 Morris 水迷宮測試大鼠行為學習記憶能力的變化 Morris 水迷宮實驗系統包括一不銹鋼圓形水池、一可調換位置的圓形透明的有機玻璃平臺，電腦以及連接電腦的攝像機。Morris 水迷宮圓形水池等分為 4 個象限，平臺置于第 4 象限中央位置，平臺低于水面 2 cm.在各象限中間標記入水點，將大鼠面向池壁分別從 3 個入水點（ 不包括第 4 象限入水點） 放入水中，若大鼠入水后 60 s 未能找到平臺，則把大鼠從水中拖上平臺，并停留 10 s,接著進行下一次訓練。每組大鼠在造模前均進行水迷宮實驗，從訓練的第 3 天開始，記錄大鼠從入水尋找并爬上平臺所需要的時間（ 即逃避潛伏期） ,連續測試 5 d,每天測試 2 次，兩次平均值為當天逃避潛伏期。造模結束后的第 4 周采用同樣的方法對大鼠進行水迷宮實驗，連續測試 5 d,每天 2 次。根據每組大鼠造模前后逃避潛伏期的長短判斷各組大鼠記憶能力的變化情況。水迷宮實驗環境安靜，周圍參照物不變，室內日光燈照明，水溫 25 ℃，時間一般選在 10 ∶ 00 ~12 ∶ 00,15 ∶ 00 ~ 17 ∶ 00.
1. 2. 4 RT-PCR 法檢測 AD 大鼠皮質 Bcl-2 mRNA、Caspase-3 mRNA 的表達 PCR 反應體系（ 參考 PCR說明書） : Taq Master Mix 12. 5 μl,上下游引物各 1μl（ 10 μm） ,模板 DNA 4 μg,加 DEPC 水補至 25 μl.PCR 反應條件： 預變性 94 ℃ 2 min,變性 94 ℃ 30 s、退火50 ~60 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 1 min（ 30 個循環） ,終延伸72 ℃ 5 min.Bcl-2 引物序列： 上游為5'-GC-CTTCTTTGAGTTCGGT-3',下 游 為 5'-TCAAACA-GAGGTCGCAT-3',擴增產物片段長 188 bp; Caspase-3 引 物 序 列： 上 游 為 5'-CAGAGCTGGACTGCGG-TATT-3',下 游 為 5'-CCATGACCCGTCCCTTGAAT-3',擴增產物片段長 146 bp; β-actin 引物序列： 上游為 5'-CCTTCTTGCAGCTCCTCCGTC-3',下 游 為 5'-TCTCCATATCGTCCCAGTTGGTG-3',擴增產物片段長 299 bp.PCR 反應產物經 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用 LeicaQ5100W 型全自動圖像分析儀分析電泳結果。
1. 2. 5 Western blot 檢測 AD 大鼠皮質 Bcl-2 蛋白表達及 Caspase-3 活性 造模后水迷宮試驗后，從各組中隨機選取 5 只大鼠斷頭取腦，分離皮質，依照WIP 組織細胞裂解液說明書提取蛋白，用 BCA 法檢測樣本蛋白濃度。樣品的上樣體積為30 μl（ 總蛋白量為 30 μg） ,用 12% 的凝膠進行 SDS-PAGE 電泳；轉膜后以 5%的脫脂奶封閉液封閉； 一抗（ 1 ∶ 300）孵育 2 h; 用 TBST 洗膜 3 次（ 10 min/次） ; 加入二抗（ 1 ∶ 6 000） 孵育 1 h; 洗膜。用 Western blot 發光試劑盒發光、顯影、定影。用全自動數碼成像分析系統對結果進行分析。
1. 3 統計學處理
采用 SPSS 17. 0 統計軟件進行分析，數據以珋x ± s 表示，多組間比較采用單因素方差分析。
2 結果
2. 1 學習記憶能力的變化（ 逃避潛伏期） 造模前各組大鼠的逃避潛伏期差異無統計學意義。造模后，Aβ1-42 纖維組、Aβ1-42 寡聚體組大鼠逃避潛伏期與正常組和 PBS 對照組相比均延長（ P < 0. 05） ,以 Aβ1-42 寡聚體組變化更顯著。見表 1.2. 2 皮質 Bcl-2 mRNA、Caspase-3 mRNA 表達水平 與正常組相比，Aβ1-42 纖維組、Aβ1-42 寡聚體組的 Bcl-2 mRNA 表達降低（ P <0. 05） ,而 Caspase-3 mRNA 的表達增高（ P < 0. 05） ; 與 Aβ1-42 纖維組比較，Aβ1-42 寡聚體組變化更明顯。見圖 1.【圖1】
2. 3 皮質 Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達水平 Aβ1-42纖維組和 Aβ1-42 寡聚體組大鼠皮質 Bcl-2 蛋白表達比正常組低，差異有統計學意義（ P <0. 05） ,而有活性的 Caspase-3 在 Aβ1-42 纖維組和 Aβ1-42 寡聚體組表達增高（ P <0. 05） .見圖 2.【圖2】
3 討論
3. 1 Aβ1-42 寡聚體神經毒性對學習記憶能力的影響 AD 患者腦內老年斑的 Aβ 主要是以纖維體的形式存在，Aβ 寡聚體是纖維體的一種過渡形式，是目前認為具有較大神經毒性的 Aβ 存在形式。Aβ對神經元有毒性作用，在體內外均可引起神經元凋亡，其異常代謝將會導致各種病理改變，在 AD 發生和發展過程中起關鍵作用.
利用 Morris 水迷宮試驗檢測大鼠學習記憶能力的變化。大腦額葉皮質和海馬在學習記憶中起著重要作用。當大腦皮質和海馬病變時，其學習記憶能力會受到影響，而具有神經毒性的 Aβ 寡聚體主要沉積在皮質和海馬中，從而影響學習記憶能力。本研究在造模前進行的水迷宮試驗主要是觀察大鼠的學習能力，而給藥后再次使用水迷宮試驗是對記憶的提取和再鞏固，根據造模前后兩次逃避潛伏期長短的變化來判斷 Aβ 寡聚體對大鼠學習記憶能力的影響。從實驗結果可知，造模前各組大鼠學習記憶能力無明顯差異，造模 4 周后，Aβ1-42 纖維組、Aβ1-42 寡聚體組逃避潛伏期較造模前均延長，但以Aβ1-42 寡聚體組變化更顯著，正常組和 PBS 對照組無明顯變化，由此可知 Aβ1-42 寡聚體比 Aβ1-42 纖維毒性更大，更易損害 AD 大鼠學習記憶功能。當寡聚體 Aβ 轉化成纖維化 Aβ，其神經毒性會降低。
成年動物大腦皮質神經元在正常情況下不具有分裂增殖能力，但在一定誘導條件下可分裂再 生。
Varvel et al發現在體外制備的 Aβ 寡聚體，在皮質神經元分裂的過程中可誘導 DNA 的合成，但這一過程可被特定的 Aβ 寡聚體抗體阻止，低分子量的 Aβ寡聚體可誘導 AD 模型小鼠的神經元細胞進入細胞分裂周期。
3. 2 Caspase-3 與 Aβ1-42 寡聚體的細胞毒性Caspase-3 在細胞凋亡中扮演重要角色。有研究表明 Caspase-3 首先定位于 AD 患者突觸后密集區，并在這一區域表達升高，其在突觸變性疾病進展過程中起重要作用。本研究檢測各組 AD 大鼠皮質的Caspase-3 mRNA 的表達及 Caspase-3 活性，與正常組及 PBS 對照組比較發現，Aβ1-42 纖維組和 Aβ1-42 寡 聚 體 組 皮 質 Caspase-3 mRNA 表 達 上 調，Caspase-3 活性增高，其在 Aβ1-42 寡聚體組中變化更顯著，故可知 Aβ1-42 寡聚體能誘導 Caspase-3mRNA 表達，激活 Caspase-3,更容易誘導細胞凋亡。
有活性的 Caspase-3 會引發廣泛的神經元破壞和退化，但不引起神經元細胞急性死亡.
3. 3 Bcl-2 與 Caspase-3 的關系 Bcl-2 是一個抑制凋亡基因，作為 Caspase 上游調控機制，其過度表達能抑制各種因素誘發的 Caspase 激活和凋亡，可能通過抑制細胞色素 C 等從線粒體的釋放調控著線粒體滲透性轉換孔的開啟，從而抑制 Caspase-3 活化。另外，Bcl-2 還可阻止線粒體釋放 Caspase-3,并抑制其合成.Bcl-2 又是 Caspase-3 的直接底物，Bcl-2 蛋白的環區可被 Caspase-3 在 Asp34 處剪切.如果 Bcl-2 表達水平改變的同時伴隨著天門冬氨酸受體的改變，可導致鈣離子失衡，從而激活Caspase-3,誘導細胞凋亡.
本研究顯示，與正常組和 PBS 對照組相比，Aβ1-42 纖維組及 Aβ1-42 寡聚體組皮質中 Bcl-2mRNA 及 Bcl-2 蛋白表達均降低，其中 Aβ1-42 寡聚體組的 Bcl-2 變化更明顯。由此可知當 Aβ1-42 激活 Caspase 酶原后，Bcl-2 表達減少，細胞抑制凋亡的能力減弱，促凋亡的作用增強。
參考文獻
[1] 吳思緲，周黎明。 阿爾茨海默病的發病機制及藥物治療的進展[J]. 四川生理科學雜志，2009,31（ 1） : 36 -9.
[2] Bitan G,Kirkitadze M D,Lomakin A,et al. Amyloid beta-protein（ Abeta） assembly: Abeta 40 and Abeta 42 oligomerize throughdistinct pathways[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100 （ 1） :330 - 5.
[3] Portelius E,Dean R A,Gustavsson M K,et al. A novel Aβ isoformpattern in CSF reflects γ-secretase inhibition in Alzheimer disease[J]. Alzheimer Res Ther,2010,2（ 2） : 7.
[4] Sultana R,Banks W A,Butterfield D A. Decreased levels ofPSD95 and two associated proteins and increased levels of BCl2and caspase 3 in hippocampus from subjects with amnestic mildcognitive impairment: Insights into their potential roles for loss ofsynapses and memory,accumulation of Abeta,and neurodegenera-tion in a prodromal stage of Alzheimer' s disease [J]. J NeurosciRes,2010,88（ 3） : 469 - 77.
[5] 廉 潔，張海燕，劉天寶，等。 復方地黃湯對老年性癡呆大鼠海馬神經元細胞凋亡和 Cyt-C 的影響[J]. 醫學研究雜志，2011,（ 4） : 86 -8.
[6] Varvel N H,Bhaskar K,Patil A R,et al. Abeta oligomers induceneuronal cell cycle events in Alzheimer's disease[J]. J Neurosci,2008,28（ 43） : 10786 - 93.
