海馬是大腦中被廣泛研究的熱點腦區之一,海馬 CA1 和 CA3 神經元是實驗研究中常用的兩類神經元且均勻的位于清晰易見的細胞帶上,與一些生理行為學和神經系統疾病研究相關聯。CA1 神經元具有明顯的海馬信號輸出環路,在長時程記憶和相對空間任務及行為學上有重要作用。CA3 神經元位于大腦顳葉海馬里,被各種抑制性神經元所調節,CA3 神經元從齒狀回神經元接收信息與 CA1 神經元有雪佛側枝相連接,也被應用于記憶方面的研究。另外,CA1 和 CA3 神經元異常放電亦與癲癇等神經系統疾病有關。該實驗制作急性海馬腦片,比較分析 CA1 和 CA3 神經元基本電生理特性,為記憶和神經疾病等研究提供一定的理論基礎。

1、 材料與方法

1. 1 實驗動物 C57 /BL6 型小鼠 10 只,出生約 14d,體重約 30 g,清潔級,由北京維通利華公司提供,雌雄不限。

1. 2 儀器與試劑

1. 2. 1 主要儀器 Leica VT 1200 型振動切片機\\(Leica Biosystems Nussloch GmbH,德國\\);電極拉制儀\\(P-98,美國\\);膜片鉗系統\\(HEKA,德國\\);相差紅外微分干涉顯微鏡\\(Olympus,日本\\)。

1. 2. 2 主要試劑 實驗試劑均購自美國 Sigma 公司。解剖液\\(mmol/L\\): Sucrose 213、Glucose 10、KCl3、NaH2PO41、CaCl20. 5、MgCl25、NaHCO326,用NaOH 或 HCl 調 pH 至 7. 30 ~ 7. 40,滲透壓約為 310mOsm。人工腦脊液 \\( mmol / L \\): Glucose 10、NaCl125、KCl 5、NaH2PO41. 2、CaCl22. 6、MgCl21. 3、NaHCO326,調 pH 至 7. 30 ~ 7. 40。 電 極 內 液\\(mmol/L\\):KCl 145、NaCl 5、HEPES 10、EGTA 5、MgATP 4、Na2GTP 0. 3,調 pH 值至 7. 30 ~ 7. 40,滲透壓約為 310 mOsm。

1. 3 制備小鼠海馬腦片 取約 14 d 的小鼠,用 1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。麻醉昏迷后迅速移除大腦,固定頭部用手術剪刀分別沿著顱骨中線和顱底兩側方向剪開頭顱骨,同時不斷地用約 0 ℃解剖液沖洗大腦\\(解剖液預先充含 95% O2+ 5% CO2混合氣體30 min\\),然后把整個大腦置于有約0 ℃解剖液的圓盤中,用手術刀和彎鑷子剔除嗅球、小腦,沿顱中線分開兩大腦半球并除去海馬周圍白紙和皮質,修整腦塊后在底座上點少量α-氰基丙烯酸乙酯膠水以便海馬組織牢固站立,迅速將底座放在盛有約 0 ℃解剖液的切片機槽里并不斷充以混合氣體,沿矢狀位切成 400 μm 厚的腦片,把腦片放在盛有人工腦脊液\\(預先充混合氣體 30 min\\)的玻璃杯中室溫下孵育 1 ~2 h 后備用。

1. 4 固定及灌流腦片 應用蓋網固定法,即鉑金絲制作 U 型框架周圍繞以尼龍線繩并膠粘固定。把 U型網框架輕放于腦片上,用蠕動泵向腦片恒速灌流混合氣體飽和的人工腦脊液,流速 1 ~ 2 ml/min,使腦片浸泡在液面下 2 mm。

1. 5 神經元形態學觀察及電生理記錄 應用紅外顯微鏡結合電荷耦合攝像系統觀察腦片 CA1 與CA3 神經元結構特點。電壓鉗下,鉗制電位在 - 60mV,記錄神經元自發放電電流,給予步階脈沖刺激記錄不同離子通道電流并作電流-電壓曲線;電流鉗下,記錄海馬神經元的靜息膜電位值和動作電位變化情況。這些獲得的信號通過放大器放大后輸出,應用 IGOR 軟件分析作圖。

1. 6 統計學處理 采用 Graphpad Prism 5. 0 軟件進行統計分析。數據以 x珋 ± s 表示,兩組間比較采用t 檢驗,多組間比較用方差分析\\( Two-Way ANOVA\\) 。

2、 結果

2. 1 腦片神經元的選擇和形態學觀察 10 倍鏡下沿著腦片錐體細胞線找到海馬 CA1 與 CA3 區域,然后換成 40 倍鏡觀察細胞,通過紅外微分干涉顯微鏡結合電荷耦合攝像系統可以看到 CA1 與 CA3 神經元立體結構清晰,胞體與突起明顯,胞體呈錐形或橢圓形,死亡細胞少,CA1 神經元胞體相對 CA3 神經元胞體較小,選擇這兩個區域的神經元進行膜片鉗電生理記錄,高阻封接順利。

2. 2 全細胞膜片鉗記錄

2. 2. 1 電壓鉗模式 鉗制電位在 - 60 mV,記錄海馬 CA1 神經元的自發性突觸后電流和 CA3 神經元的自發性突觸后電流,見圖 2。分析其電流的幅度和頻率,CA1 和 CA3 神經元突觸后電流幅度和頻率分別為[\\(531. 10 ±88. 03\\) PA,n =9],[\\(305. 00 ±90. 03\\)PA,n = 6]和[\\(0. 74 ± 0. 15\\) Hz,n = 9],[\\(1. 08 ± 0. 12\\)Hz,n = 6],二者之間差異無統計學意義\\(t =1. 72,P = 0. 10;t = 1. 60,P = 0. 13\\)。鉗制電位置于 - 60 mV,從 - 60 mV 開始給予 20 mV 步階脈沖去極化刺激至 80 mV,每個刺激時間為 200ms,可以記錄到全細胞跨膜總電流變化圖形,外向電流為鉀離子通道電流,內向電流為鈉離子通道電流,見圖 3。以去極化電壓為橫軸,以神經元在該刺激電壓時產生的離子電流幅值為縱軸繪制出離子通道的電流-電壓\\(I-V\\)曲線,用電流密度代替電流幅值\\(電流密度 = 離子電流幅值/膜電容,單位為 PA/PF\\) 計算。從圖 4 可知,CA1 與 CA3 神經元鉀離子通道激活電壓約在 - 50 mV,隨著去極化脈沖電壓的增加,電流密度也隨著增加,CA1 與 CA3 神經元鉀離子通道電流密度二者之間差異無統計學意義\\(F =4. 41,P = 0. 05\\),給予不同去極化脈沖電壓與鉀離子通道電流密度二者之間差異有統計學意義\\(P <0. 05\\);CA1 與 CA3 神經元鈉離子通道電流密度約在 -50 mV 激活去極化,-40 mV 后逐漸變小,二者之間差異無統計學意義\\(F = 3. 04,P = 0. 09\\),給予不同去極化脈沖電壓與鈉離子通道電流密度二者之間差異有統計學意義\\(P <0. 05\\)。

2. 2. 2 電流鉗模式 全細胞電流鉗模式下記錄海馬腦片 CA1 與 CA3 神經元的動作電位放電情況見圖 5。分析 CA1 與 CA3 神經元的動作電位幅度和頻率,結果顯示 CA1 與 CA3 神經元動作電位的幅度和頻率分別為 [\\(93. 19 ± 4. 08\\) mV,n = 12],[\\(101. 10 ± 4. 42\\)mV,n = 10]和[\\(0. 96 ± 0. 33\\)Hz,n = 12],[\\(0. 95 ± 0. 34\\)Hz,n = 10],二者之間差異無統計學意義\\(t = 1. 30,P = 0. 20;t = 0. 02,P= 0. 97\\)。海馬 CA1 與 CA3 神經元靜息膜電位分別為[\\( - 60. 07 ± 0. 43\\) mV,n = 12],[\\( - 60. 44 ±1. 39\\)mV,n = 10];海馬 CA1 與 CA3 神經元動作電位峰峰間距分別為[\\(4 601. 00 ±1 785. 00\\) ms,n =12\\)],[\\(3 884. 00 ± 1 654. 00\\)ms,n = 10],二者之間差異均無統計學意義\\(t = 0. 27,P = 0. 78;t =0. 29,P = 0. 77\\)。鉗制電位置于 -60 mV,以 50 PA步階脈沖電流從 - 650 PA 至 50 PA,可記錄到海馬CA1 與 CA3 神經元動作電位發放,見圖 6A、B。取步階脈沖電流從 -300 PA 到 -50 PA 的動作電位發放數作統計,結果顯示步階脈沖電流與動作電位發放數二者之間差異有統計學意義\\(P < 0. 05\\),海馬CA1 與 CA3 神經元動作電位發放數二者之間差異無統計學意義\\(F =3. 57,P =0. 06\\)。

3、 討論

細胞培養或急性分離的細胞可以用于多項實驗技術的研究,卻難以運用于膜片鉗記錄研究所需電流,且對神經細胞離子通道有不同程度的損傷,過程復雜。離體海馬腦片具有有序排列的神經元和神經纖維、完整的神經解剖通路、定位明顯的胞體突起、穩定的離子通道性質等特點,易于進行電生理記錄操作,已成為研究神經系統突觸可塑性和神經系統疾病的良好標本。研究顯示,離子通道廣泛存在于神經系統中,與神經系統疾病\\(如腦缺血、脊髓缺血、癲癇及抑郁等\\)密切相關,且有些離子通道在腦缺血和癲癇的治療中發揮重要的保護作用;同時離子通道受體也是一些藥物作用的靶點。急性離體腦片培養是近年發展起來的一種器官培養方法,相比于傳統的體外培養的神經元,離體腦片既保留了細胞的組織結構,還保留了細胞與細胞的內在聯系。更重要的是,腦片培養可以模擬在體生理環境排除了實驗中 pH 值、溫度、離子濃度等不利因素的影響,為研究離子通道的生理特性和藥理特性等提供了理想的模型需求。

本實驗結果顯示,海馬腦片能夠清晰的觀察CA1 與 CA3 神經元的結構特征和電生理特性。結構上,CA1 與 CA3 神經元立體結構清晰,樹突胞體明顯;與 CA3 神經元相比,CA1 神經元頂樹突較長,樹突分支較多形成一個樹突樹,胞體直徑較小;這些結構特征在急性培養的神經元很難觀察到。另外,CA1 神經元與 CA3 神經元結構上的異同源于單個神經元內部特性還是區域環路因素,目前還未完全清楚。從本實驗結果顯示,CA1 與 CA3 神經元自發突觸后電流的幅度達幾百甚至上千 PA,發放頻率約在 1. 0 Hz。CA1 與 CA3 神經元靜息膜電位值均約在 -60 mV,未注射去極化電流時,動作電位的幅度大約 100 mV,發放頻率在 1 ~10 Hz;在給予注射去極化電流時,動作電位的閾電位約在 -50 mV,這些電生理特性與以往的文獻報道相一致。鉀離子電流對調節神經元的興奮性至關重要,CA1 與CA3 神經元鉀離子通道表達特性的不同也許能夠解釋其放電形式的不同,這也幫助理解為什么 CA1 神經元參與癲癇樣放電事件的發生比 CA3 神經元多。

綜上所述,制備急性離體海馬腦片能夠模擬在體環境使離子通道性質保持穩定,CA1 與 CA3 神經元結構及電生理特性的異同,決定了具有類似而又不同的功能,為進一步研究與 CA1 和 CA3 神經元相關的神經系統疾病等提供了理論基礎。

參考文獻:
[1] 林毅勇,邵福源,孫 剛,等. 急性缺氧對大鼠海馬神經元 N-甲基-D-天門冬氨酸誘發電流的影響[J]. 中國臨床康復,2004,8\\(4\\) :634 - 6.