藁苯內酯為當歸、川芎等傘形科植物的特有活性成分，具有松弛平滑肌、改善微循環、鎮痛及抑制平滑肌細胞增殖等作用，還能明顯保護大鼠由于腦部缺血、前腦灌注不足及 β 樣淀粉蛋白引起的腦部損傷，其可能的機制包括提高中樞膽堿能活性、抑制神經炎癥反應及增強機體抗氧化和抗凋亡的能力。興奮性毒性是指由于谷氨酸鹽及其類似物等神經遞質的過度產生而導致神經細胞的損傷及死亡的病變。許多急性或者慢性的神經性疾病\\( 包括中風和阿爾茲海默癥\\) 都與神經元的興奮性毒性有關?，F研究藁苯內酯對由神經興奮性毒素鵝膏蕈氨酸注入基底核大細胞內致大鼠神經行為學缺陷的影響和神經病理學的改變。

1、 實驗部分

1． 1 儀器、試藥與動物

Morris 水迷宮測試儀 \\( 成都泰盟科技有限公司\\) 。藁苯內酯\\( LIG，香港理工大學，從當歸的干燥根中提取分離和純化，純度 ＞99%，使用時用3% 吐溫 80 配制\\) ; 鵝膏蕈氨酸\\( IBO，美國 Sigma\\) ; NSE、GFAP、TNF － α 多克隆抗體\\( 武漢博士德生物工程有限公司\\) ; OX －42 \\( 英國 Abcam\\) ?！醀istar 大鼠\\( SPF 級，重慶市騰鑫生物技術有限公司，合格證號:SYXK 2008 － 24\\) ，體重 250 ～ 300 g。

1． 2 方法與結果

1． 2． 1 動物的分組 將 40 只♂Wistar 大鼠隨機均分為假手術組\\( sham\\) 、模型組\\( vehicle\\) 和 LIG 高\\( LIG10\\) 、低\\( LIG2． 5\\) 劑量組\\( 10、2． 5 mg·kg－ 1LIG\\) 。

1． 2． 2 IBO 損傷模型的建立及術后動物的處理參照文獻的方法，制備大鼠 IBO 損傷模型。大鼠按 50 mg·kg－ 1ip 3% 戊巴比妥鈉麻醉后，將其頭固定在腦立體定向儀上。參照大鼠腦立體圖譜，以前囟為基點，后移 0． 9 mm，旁開 2． 4 mm，以牙科鉆鉆開顱骨，用 5 μL 微量注射器垂直進針，向下 7. 5mm，緩慢將 1 μL 5 μg·μL－ 1IBO 注入大鼠雙側基底核大細胞\\( NBM\\) 內。假手術組大鼠 ip 等量生理鹽水; LIG 高、低劑量組大鼠于術后 24 h 分別 ig 給予 10、2． 5 mg·kg－ 1LIG，每天 1 次; 模型組和假手術組大鼠則同時 ig 給予等體積 3% 吐溫 － 80 溶液。給藥第 15 天開始進行水迷宮測試。

1． 2． 3 水迷宮試驗 參照 Morris 水迷宮測試方法，評價動物空間學習和記憶能力。測試包括隱匿平臺試驗: 共進行4 d，每天訓練4 次，訓練間隔時間60 s，記錄大鼠在 90 s 內逃逸潛伏期; 探針試驗: 水迷宮測試第 5 天撤除平臺，從原平臺象限對側池壁的中點將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠 90 s 內在目標象限\\( 原平臺所在象限\\) 停留的時間。在隱匿平臺試驗中，模型組大鼠的逃逸潛伏期較假手術組的明顯延長\\( P ＜ 0． 01\\) ; LIG 低劑量組比模型組的逃逸潛伏期有所縮短，但并無顯著性差異; LIG 高劑量組的逃逸潛伏期比模型組的明顯縮短\\( P ＜0. 01\\) 。在探針實驗中，模型組比假手術組的大鼠在目標象限\\( 原平臺所在象限\\) 停留的時間明顯縮短\\( P ＜0． 01\\) ; LIG 高劑量組與模型組的大鼠比較，目標象限停留的時間顯著性增加\\( P ＜0. 01\\) 。表明LIG 對 IBO 誘導的 NBM 損傷大鼠的空間學習記憶損傷有明顯的改善作用\\( 圖 1\\) 。

1． 2． 4 免疫組織化學 探針試驗結束后，將大鼠麻醉后開胸腔，剪開右心耳，從左心室灌注約 200 mLpH7． 4 PBS、約 100 mL 4% 多聚甲醛?？焖匍_顱，取全腦、去除小腦、腦干及嗅球，置 10% 中性甲醛中固定 24 ～ 48 h，制作腦部冠狀石蠟切片，進行病理檢測。石蠟切片用 3% H2O2漂洗 15 min、用 5% 牛血清蛋白孵育 30 min 滅活內源性過氧化物酶。切片分別用不同的一抗進行孵育: NSE \\( 1∶50\\) 、OX －42 \\( 1 ∶100 \\) 、GFAP \\( 1 ∶ 100 \\) 或 TNF － α \\( 1 ∶100\\) ，于 4 ℃ 下過夜。滴加生物素化羊抗兔 / 小鼠IgG 后，于 37 ℃ 孵育 1 h，滴加 SABC，于 37 ℃ 孵育 1h，DAB 染色、蘇木素輕度復染，常規脫水、二甲苯透明、中 性 樹 膠 封 片。 以 Olympus － BX51microscope － DPTO － camera 圖像系統觀察并采圖。

免疫組織化學染色結果的定量分析采用 Image － ProPlus 6． 0 軟件。

1． 2． 5 IBO 誘導的神經元損傷的保護作用 NSE的表達被視作 IBO 對大腦損傷程度的判斷指標。NSE 免疫組化結果顯示: 模型組大鼠皮層的 NSE 陽性細胞數明顯低于假手術組，用 LIG 高劑量治療后NSE 陽性細胞數量增加。表明 LIG 對 IBO 誘導的神經元損傷具有保護作用\\( 圖 2\\) 。

1． 2． 6 LIG 對 IBO 誘導的膠質細胞活化和神經炎癥的抑制作用 在大鼠的基底核大細胞內注射 IBO后，用免疫染色的方法檢測星形膠質細胞，小膠質細胞和炎性因子的病理學變化。結果顯示: 模型組GFAP、OX － 42、TNF － α 的表達明顯高于假手術組，而 LIG能夠降低GFAP、OX － 42、TNF － α的表達，表明 LIG 能夠抑制膠質細胞的活化和神經炎癥的產生\\( 圖 3\\) 。

1． 2． 7 統計分析 實驗數據以珋x ± s 的方式表示，采用 SPSS16． 0 軟件進行統計分析。水迷宮隱匿平臺試驗測試的結果采用重復測量數據的雙因素方差分析\\( two － way AVONA\\) ，其他實驗結果采用單因素方差分析\\( one － way AVONA\\) ，組間差異采用 posthoc LSD 檢驗。P ＜ 0． 05 為有顯著性差異。

2、 討論

神經毒素鵝膏蕈氨酸\\( IBO\\) 為 N － 甲基 － D －天冬氨酸\\( NMDA\\) 受體激動劑，激活 NMDA 受體后會引起一些神經行為的缺失和神經病理反應。用IBO 造成 NBM 損傷的大鼠通常被用作興奮性毒性腦損傷的模型。文中觀察到 IBO 注射到大鼠NBM 內可致認知能力受損和神經病理學改變，這與文獻報道相符。在給予 IBO 20 d 后，與假手術組比較，模型組大鼠在水迷宮定位航行實驗中的逃逸潛伏期明顯變長; 探針實驗中，在目標象限停留的時間明顯縮短。從 NSE 免疫染色中可以看到: 模型組大鼠的神經元形態有顯著改變，活細胞數目也明顯減少。但在注射 IBO 后 24 h 時給予 10 mg·kg－ 1藁苯內酯\\( LIG\\) 就可顯著改善大鼠在水迷宮中的學習和記憶能力，并且使神經元的形態和數量都恢復到接近正常水平。小膠質細胞是中樞神經系統的一種免疫細胞，可以被多種病理因素活化?；罨男∧z質細胞開始增殖并且產生多種炎性因子如 TNF －α，這些因子會導致神經元損傷，因此，膠質細胞病理性的活化會加重興奮性毒性。文中結果顯示:

相比假手術組，模型組大鼠出現了膠質細胞的異?；罨痋\( 如活化的小膠質細胞和星形膠質細胞\\) ，TNF － α 的表達量也上調，但是這些病理改變都可以被 LIG 顯著抑制。實驗結果提示: LIG 可能通過抑制膠質細胞的活化和后續的神經驗證反應來緩解興奮性腦損傷。