肝損傷是多種肝臟疾病共有的一種病理狀態，具有發病率高、病程長、難治愈、易反復等特點，嚴重危害到人們的身體健康。疏肝健脾方\\(又名肝樂顆粒、肝樂沖劑\\) 依據"見肝知脾，知肝傳脾，當先實脾"理論創制而成，具有疏肝解郁、健脾滲濕、活血化瘀之功效，用于急慢性肝炎、肝纖維化、肝硬化活動期，臨床療效確切。本研究采用一次性腹腔注射 0． 1% 四氯化碳復制肝損傷小鼠模型，觀察疏肝健脾方不同提取工藝對其的保護作用。
1、 材料與方法
1． 1 試驗藥物 藥材源于安徽中醫藥大學第一附屬醫院草藥房，經孟楣主任中藥師鑒定為正品。疏肝健脾方水提物: 按照處方比例，精確稱取茵陳，板藍根、薏苡仁等藥材重量，加 8 倍量水煎煮 2 次，每次 1h，合并兩次水煎液濃縮成浸膏，備用。疏肝健脾方醇提物: 精確稱取上述藥材，加 8 倍量 80% 乙醇煎煮 2 次，每次 1h，減壓蒸去乙醇濃縮成浸膏，備用。疏肝健脾方醇水雙提物: 精確稱取上述藥材，第一次加 8 倍量 80% 乙醇煎煮 1 小時，過濾煎液; 第二次加 8 倍量水煎煮 1 小時，過濾煎液，合并兩次濾液，濃縮成浸膏，備用，不同提取物浸膏得率如表 1 所示。
聯苯雙酯: 北京協和制藥廠產品。
1． 2 動物 昆明種小鼠，體重 20 ± 2g，雄性，由安徽省實驗動物中心提供，許可證號: SYKK\\(皖\\) 2012 -002，SPF 級。
1． 3 試劑 四氯化碳\\(CCl4\\) ，天津市富宇精田化工有限公司;丙氨酸氨基轉移酶\\(alanine aminotransferase，ALT\\) 、天冬門氨酸氨基轉移酶\\(aspartate aminotransferase，AST\\) 、超氧化物歧化酶\\(superoxide dismutase，SOD\\) 、丙二醛\\(malondialdehyde，MDA\\) 、谷胱甘肽過氧化物酶\\(glutathione peroxidase，GSH-Px\\) 試劑盒，南京建成生物工程研究所; 兔抗鼠 NF-κB、TNF-α 單克隆抗體、DAB 顯色試劑，河北博海生物工程開發有限公司。
1． 4 儀器 GL-20A 全自動冷凍高速離心機，湖南儀器儀表總廠離心機廠; BIOＲAD680 酶標儀，美國伯樂公司。
1． 5 方法 小鼠適應性飼養一周后，隨機分為正常對照組、模型組、疏肝健脾方水提、醇提、醇水雙提\\(15． 6g/kg\\) 組和聯苯雙酯\\(BP，0． 1g/kg\\) 組，每組 10 只。灌胃給予不同工藝制備的提取物，每天 1 次，連續 10d，正常對照組和模型組給予等量溶媒。末次給藥 8h 后腹腔注射 0． 1%CCl4橄欖油溶液\\(10ml/kg\\) 復制化學性肝損傷模型，16 小時取樣。
1． 5． 1 肝臟病理組織學觀察 取固定部位肝組織，置于 10 %福爾馬林液中固定，48h 后常規脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE 染色、脫水、透明、封片，普通光學顯微鏡下觀察病理組織學改變。
1． 5． 2 血清 ALT、AST 的含量 血清 ALT、AST 含量采用分光光度計法測定，嚴格按試劑盒說明書的操作步驟進行操作。
1． 5． 3 肝組織 SOD、MDA、GSH-Px 的含量 取肝臟組織，用冷生理鹽水洗去浮血，拭干，稱取 0． 3g 肝組織，制成 10% 的肝勻漿。進行 SOD、MDA、GSH-Px 含量的測定，具體遵照說明書進行。
1． 5． 4 肝組織中 NF-κB、TNF-α 的表達 采用檸檬酸鈉緩沖液熱抗原修復，S-P 法免疫組織化學染色，用 DAB/H2O2顯色，蘇木精復染。具體操作按試劑盒說明書，用已知陽性切片作為陽性對照，用 PBS 代替一抗作為陰性對照，具體遵照說明書進行。
2、 結果
2． 1 疏肝健脾方不同提取物對化學性肝損傷小鼠肝臟病理組織學改變的影響 HE 染色顯示，正常組肝細胞結構清晰，肝細胞核大而圓，核膜清晰，核仁明顯，胞質豐富; CCl4模型小鼠細胞核斷裂，肝細胞呈較廣泛的嗜酸性壞死，肝細胞腫脹較明顯，脂肪變性，形成空泡; 疏肝健脾方各組和 BP 組均可減輕病變程度與范圍，提示對化學性肝損傷小鼠具有一定的保護作用，結果見圖 1。
2． 2 疏肝健脾方不同提取物對化學性肝損傷小鼠血清轉氨酶的影響 CCl4誘導的模型組血清 ALT、AST 含量明顯升高，與正常組相比，差異具有顯著性; 而給予的疏肝健脾方不同提取物和 BP 組血清中 ALT、AST 水平明顯得到降低，結果見表 2。
2． 3 疏肝健脾方不同提取物對化學性肝損傷小鼠肝勻漿 SOD、MDA、GSH-Px 水平的影響 與正常組相比，CCl4誘導的模型組肝勻漿 MDA 含量明顯升高，而 SOD、GSH-Px 含量顯著降低，給予疏肝健脾方各組干預 10d 后，可顯著降低肝勻漿 MDA 水平，升高 SOD 和 GSH-Px 水平，結果見表 3。
2． 4 疏肝健脾方不同提取物對化學性肝損傷小鼠肝組織中NF-κB、TNF-α 蛋白表達的影響 NF-κB 和 TNF-α 蛋白免疫組化染色以棕黃色或深棕黃色為陽性表達，主要分布在肝細胞的胞質和/或胞漿。正常肝組織中 NF-κB、TNF-α 少量表達; 模型組中 NF-κB、TNF-α 廣泛表達，疏肝健脾方不同提取物組表達明顯減弱，陽性面積明顯減小，表明疏肝健脾方各組均可抑制 NF-κB、TNF-α 活性，結果見圖 2、3。
3、 討論
CCl4誘發的化學性肝損傷模型，是常用的經典肝損傷病理模型之一。CCl4通過破壞肝細胞及其內膜機構，損壞肝細胞，致使胞漿中的酶如 ALT、AST 等釋出入血。因此，血清中ALT 和 AST 水平高低可敏感地反映肝損害的程度。本研究發現 CCl4誘導的模型組小鼠肝細胞呈較廣泛的嗜酸性壞死，肝細胞腫脹較明顯，ALT、AST 含量明顯升高，表明模型復制成功。
給予疏肝健脾方不同提取物干預后，肝組織損傷程度明顯減輕，肝功能得到顯著改善，提示疏肝健脾方不同提取物對化學性肝損傷小鼠具有一定的保護作用。脂質過氧化在化學性肝損傷中具有重要的作用。SOD是人體內最重要的自由基清除劑，能清除超氧陰離子自由基，保護生物膜免受損傷，對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用。MDA 是脂質過氧化最終產物，其含量與脂質過氧化程度成正比。GSH-Px 是機體重要抗氧化酶，它可以催化H2O2還原成水，在這一反應中，GSH 可作為供氫體參與反應，阻斷了超氧陰離子通過中間體 H2O2生成高活性的膜過氧化劑·OH 的途徑，從而保護細胞免受氧自由基的毒性損害。本研究發現疏肝健脾方不同提取物可升高 SOD、GSH-Px 含量，降低MDA 含量。
NF-κB 是一種廣泛存在于體內多種細胞的核轉錄因子，能介導多種炎性介質轉錄表達，參與了細胞凋亡的調控，還能促進TNF-α 等因子在急性肝損傷中的表達。肝臟是產生 TNF-α的主要器官，可誘導氧自由基的產生及脂質過氧化，從而導致肝損傷。本研究表明疏肝健脾方不同提取物可明顯抑制 NF-κB、TNF-α 蛋白的表達。綜上所述，疏肝健脾方不同提取物對化學性肝損傷小鼠具有一定的保護作用，以醇水雙提物效果最為顯著，其機制可能與增強機體抗脂質過氧化有關。
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