復方丹參片的主要功效和主治是活血化瘀，治療冠心病心絞痛等癥狀。丹參酸 B 是復方丹參片的主要活性成分，由于丹參酸 B 的半衰期較短，生物半衰期t1 /2= \\( 16． 58 ±5． 768\\) min，因此設計復方丹參緩釋片以維持血藥濃度，可以提高藥品的療效和患者的依從性。因此在緩釋制劑研制中，需要進行藥物動力學和生物等效性研究。本試驗根據\\( 《中國藥典》2010 版\\)緩釋、控釋和遲釋制劑指導原則及國家中藥天然藥物注冊申報要求進行復方丹參膜控緩釋片與復方丹參片在 Beagle 犬體內的藥動學及生物利用度的比較研究。

1 儀器與材料

1． 1 儀器
儀器: 島津 LC-10A 型高效液相色譜儀; SK300LH超聲儀，上?？茖С晝x有限公司; 離心機: Tdl5M 臺式大容量冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司;TGL-20B 高速離心機，上海安亭科學儀器廠。

1． 2 試藥
復方丹參緩釋片，復方丹參緩釋片素片\\( 未包衣，自制\\) ; 復方丹參片\\( 廣東一力集團制藥有限公司，批號為:6090612\\) ; 丹酚酸 B 照品\\( 中國藥品生物制品檢定所，批號為:111562－200807\\) ; 乙睛，甲醇\\( 色譜純\\) ; 肝素\\( 上海生物化學制藥廠\\) ; 其它試劑均為分析純。

1． 3 試驗動物
成年 Beagle 犬 6 只，雌雄各半，體質量為 9． 5 kg，由廣州市醫藥工業研究所廣東省 Beagle 犬種質資源研究開發中心\\( 國家 Beagle 犬種子基地\\) 提供。許可證號: SCXK\\( 粵\\) 2008－0007。

2 方法與結果

2． 1 復方丹參緩釋片與素片單次給藥藥動學比較試驗方法
6 只健康 Beagle1 犬稱重，隨機分為 2 組，一組為受試藥組\\( 緩釋片，每片含丹酚酸 B 50 mg\\) ，另一組為參比藥組\\( 素片，每片含丹酚酸 B 50 mg\\) ，每組 3 只，雌雄不限。采用雙周期兩制劑交叉試驗設計，洗凈期為 1 周。

禁食 12 h 后，口服給予復方丹參緩釋片及復方丹參緩釋素片各 1 片。緩釋片組于給藥前及給藥后 15、30、45、60、90、120、150、180、210、240、360、480、600、720min 由腿部取靜脈血 3 mL; 素片組于給藥前及給藥后5、10、15、25、40、60、90、120、150、270 min 由腿部取靜脈血 3 mL，按“2． 5”項下方法處理血漿樣品。

停藥 1 周后，進行交叉實驗，方法同上。

2． 2 復方丹參片連續 3 次給藥的藥動學試驗方法
將“2． 1”所用 6 只健康 Beagle1 犬，經過 7 d 洗凈期后開始試驗。首先分別口服 3 片復方丹參片\\( 每片含丹酚酸 B 6 mg\\) ，首次給藥 4、8 h 后再次喂食 3 片復方丹參片。于首次給藥后 5、10、15、30、60、120、240、245、250、255、270、300、360、480、485、490、495、510、540、600、720 min 由腿部取靜脈血 3 mL，按“2． 5”項下方法處理血漿樣品。

2． 3 復方丹參緩釋片與復方丹參片多次給藥達穩態后的藥動學比較試驗方法
將“2． 2”所用 6 只健康 Beagle1 犬，經過 7 d 洗凈期后開始試驗。分別每隔 4． 5 h 口服 1 片復方丹參緩釋片\\( 每片含丹酚酸 B 50 mg\\) ，連續給藥 19 次，分別于第7、13、19 次給藥前由腿部取靜脈血3 mL，按“2． 5”項下方法處理血漿樣品后進行檢測，考察是否達到穩態。

于第 19 次給藥后 15、30、45、60、90、120、150、180、210、270、360、480、600 min 由腿部取靜脈血 3 mL，按“2． 5”項下方法處理血漿樣品。

將上步所用 6 只健康 Beagle1 犬，經過 7 d 洗凈期后開始試驗。分別每隔 90 min 口服 3 片復方丹參片\\( 每片含丹酚酸 B6 mg\\) ，連續給藥 16 次，于第 14、15、16 次給藥前由腿部取靜脈血 3 mL，按“2． 5”項下方法處理血漿樣品后進行檢測，考察是否達到穩態。于第16 次給藥后 5、10、15、20、25、30、40、55、90、120 min 由腿部取靜脈血 3 mL，按“2． 5”項下方法處理血漿樣品。

2． 4 血液樣品測定方法
采用高效液相色譜法對樣品進行檢測，色譜條件如下:色譜柱 C18; 流動相: 甲醇-乙腈-甲酸-水 \\( 30∶10∶1∶59\\) ;檢測波長: 280 nm; 柱溫: 30 ℃; 流速 1． 0 mL/min。

2． 5 血漿樣品的處理方法
取血樣3 mL，置于肝素化5 mL 離心管中，離心\\( 5 000r / min\\) 10 min，精密取血漿 1 mL，加入硫酸溶液 3 mL，加入乙酸乙酯 3 mL，渦旋混合 15 min，置振蕩器上振搖30 min\\( 150 次 / min\\) ，離心\\( 12 000 r / min\\) 10 min，吸取有機層，重復萃取 2 次，合并有機層，將有機層轉入尖底離心管中，置于 40 ℃ 水浴中氮氣流下吹干，殘渣用0． 2 mL 流動相溶解測定。

2． 6 體內分析方法的建立
2． 6． 1 方法的專屬性 分別取空白血漿、加入一定濃度對照溶液的空白血漿及受試家犬服藥后采集的血漿，按“2．5”項處理，進樣，得色譜圖，見圖 1。結果表明，空白血漿中的內源性物質不干擾丹酚酸 B 的分離測定?！緢D1】


2． 6． 2 精密度與重復性 取空白血漿 800 μL，按“2． 7”項下的方法配制低、中、高濃度\\( 丹酚酸 B 濃度為 0. 256、2． 56、10． 24 μg / mL\\) 的樣品，按“2． 5”項下處理后作HPLC 分析。每一濃度連續測定 5 次，計算本法的準確度與精密度。結果見表1，3 種濃度的 RSD 均小于10%?！颈?】


2． 6． 3 樣品穩定性試驗
2． 6． 3． 1 室溫保存穩定性試驗取空白血漿 800 μL，按“2． 7”項下的方法配制低、中、高濃度\\( 丹酚酸 B 濃度為0．768、2．56、10．24 μg/mL\\)的樣品，按“2．5”項下處理后作 HPLC 分析，然后于室溫避光儲存，在24 h 及 36 h 后再次做 HPLC 分析，考察預處理后的樣品在室溫下的穩定性，考察結果見表 2，可見樣品在室溫下 36 h 內保持穩定?！颈?】


2． 6． 3． 2 低溫保存穩定性試驗取空白血漿 800 μL，按“2． 7”項下的方法配制低、中、高濃度\\( 丹酚酸 B 濃度為 0． 768、2． 56、5． 12 μg/mL\\) 的樣品，按“2． 5”項下處理后作 HPLC 分析，然后于冰箱中－4 ℃儲存，分別于 2、4、7 d 后取出樣品解凍后做 HPLC 分析，考察預處理后的樣品在－4 ℃條件下的穩定性，考察結果見表 3，可見樣品在－4 ℃條件下 7d 內保持穩定?！颈?】


2． 6． 4 回收率 取空白血漿 800 μL，按“2． 7”項下的方法配制低、中、高濃度 \\( 丹酚酸 B 濃度為 0． 256、2．56、10． 24 μg / mL\\) 的樣 品，按“2． 5 ”項下處理后作HPLC 分析。以提取后獲得的色譜峰面積與未經“2．5”項下方法處理直接分析得到的色譜峰面積之比考察提取回收率，結果見表 4?！颈?】


2． 7 血樣標準曲線的制備
精密稱取丹酚酸 B 對照品 12． 8 mg，置 50 mL 棕色量瓶中，加流動相至刻度，搖勻; 取 1 mL 該溶液于25 mL 棕色量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，制成丹酚酸B 對照品溶液 G; 精密吸取丹酚酸 B 對照品溶液 G 5mL 于 10 mL 棕色量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，制成丹酚酸 B 對照品溶液 F; 精密吸取丹酚酸 B 對照品溶液 F 5 mL 于 10 mL 棕色量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，制成丹酚酸 B 對照品溶液 E; 精密吸取丹酚酸 B 對照品溶液 E 5 mL 于 10 mL 棕色量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，制成丹酚酸 B 對照品溶液 D; 精密吸取丹酚酸 B 對照品溶液 G 1 mL 于 10 mL 棕色量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，制成丹酚酸 B 對照品溶液 C; 精密吸取丹酚酸 B 對照品溶液 C 5 mL 于 10 mL 棕色量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，制成丹酚酸 B 對照品溶液 B;精密吸取丹酚酸 B 對照品溶液 B 5 mL 于 10 mL 棕色量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，制成丹酚酸 B 對照品溶液 A; 則對照品溶液 A、B、C、D、E、F、G 的濃度分別為0. 256、0． 512、1． 024、1． 28、2． 56、5． 12、10． 24 μg / mL。

分別將7 批對照品溶液200 μL 置800 μL Beagle 犬空白血漿中，加入硫酸溶液3 mL，加入乙酸乙酯3 mL，渦旋混合15 min，置振蕩器上振搖30 min\\( 150 次/min\\) ，離心\\( 12 000 r/min\\) 10 min，吸取有機層，重復萃取 2 次，合并有機層，將有機層轉入尖底離心管中，置于 40 ℃水浴中氮氣流下吹干，殘渣用 0． 2 mL 流動相溶解測定。分別取溶液 20 μL 注入液相色譜儀，測定其峰面積，以丹酚酸 B 濃度為縱坐標，峰面積為橫坐標，繪制標準曲線見圖 2，結果表明，丹酚酸 B 對照品在 0. 256～ 10． 24 μg / mL 范圍內線性關系良好?；貧w方程: y =0． 000 3x－0． 219 4，相關系數: r = 0． 997 4?！緢D2】

3 試驗結果

3． 1 單次給藥
3． 1． 1 血藥濃度測定與藥時曲線 血漿樣品按“2． 4”項下血漿樣品的分析方法操作，并以標準曲線計算各時間點樣品中丹酚酸 B 的濃度，6 只 Beagle 犬單劑量口服 50 mg 復方丹參緩釋片和 50 mg 復方丹參緩釋片素片以及連續 3 次口服 18 mg 復方丹參片后，丹酚酸 B平均血藥濃度－時間曲線見圖 3?！緢D3】


3． 1． 2 單次給藥 Beagle 犬體內的藥代動力學參數實驗數據在電腦經 3P87 程序處理，求得 6 只 Beagle 犬單劑量口服 50 mg 復方丹參緩釋片和 50 mg 復方丹參緩釋片素片以及連續 3 次口服 18 mg 復方丹參片后平均藥代動力學參數見表 5?！颈?】

3． 1． 3 復方丹參緩釋片的相對生物利用度 與未包衣的素片相比，復方丹參緩釋片的 Cmax顯著降低，而達逢時間明顯后移; 與普通片 3 次連續服用相比，達逢時間從29． 428 min 后移至81． 179 min，消除半衰期從29．383 min 延長至 261． 745 min，緩釋片與素片的相對生物利用度為 182． 4%，緩釋片與普通片的相對生物利用度為 89． 9%。

3． 1． 4 體外釋藥與體內吸收相關性考察 復方丹參緩釋片的藥動學過程符合單室模型，因此采用 Wagner-Nelson 公式計算口服后不同時間丹酚酸 B 的吸收百分數 F\\( t\\) \\( %\\) 。采用梯形面積法求出各時間點 AUC0－t，取素片的Ke= 0． 033 8 計算吸收百分數 F\\( t\\) 。結果見下表 6：【表6】


將體內吸收分數\\( F\\) 與對應的體外累計釋放百分率\\( f\\) 按最小二乘法進行線性回歸，得到以下方程:y = 1． 007 4 x－0． 005 2，r = 0． 994 8對直線方程相關系數進行統計檢驗，P＜0． 01，說明復方丹參多層緩釋片體內吸收與體外釋放相關性顯著。

3． 2 多次給藥達穩態

3． 2． 1 血藥濃度測定與藥時曲線 血漿樣品按“2． 5”項下血漿樣品的分析方法操作，并以標準曲線計算各時間點樣品中丹酚酸 B 的濃度，6 只 Beagle 多次口服50 mg 復方丹參緩釋片及 18 mg 復方丹參片后，丹酚酸B 平均血藥濃度－時間曲線見圖 4?！緢D4】


3． 2． 2 多次給藥達穩態后 Beagle 犬體內的藥代動力學參數 穩態研究中復方丹參緩釋片及復方丹參片的3 次波谷濃度見表 7，可見此時已達到穩態。實驗數據在電腦經 3P87 程序處理，求得6 只 Beagle 多次口服50mg 復方丹參緩釋片及 18 mg 復方丹參片達穩態后平均藥代動力學參數，見表 8?！颈?.表8.略】


3． 2． 3 多次給藥達穩態后復方丹參緩釋片的相對生物利用度 對表中的藥動學參數進行分析，復方丹參緩釋片與復方丹參片相比，多次給藥達穩態后達逢時間從21． 418 min 后移至83． 080 min，消除半衰期從21．802 min 延長至 219． 625 min，兩者相對生物利用度為\\( AUC緩釋片/3 AUC普通片\\) 93． 6%。

3． 2． 4 波動系數 DF 值 按下式計算波動系數 DF 值，緩釋片為 58． 13±14． 1 而普通片為 125． 48±14． 6，有顯著差異\\( P＜0． 05\\) 。DF = \\( Cmax－Cmin/ Cav×100%

4 結論與討論

由藥動學參數可知，Beagle 犬口服復方丹參緩釋片后丹酚酸 B 的體內過程符合單室模型，單次給藥與同劑量復方丹參緩釋片素片相比，最大血藥濃度顯著降低，達峰時間明顯后移，吸收半衰期和消除半衰期明顯延長; 經方差分析，比較各主要藥動學參數\\( Cmax、t1 /2、Tpeak\\) ，差異有顯著性\\( P＜0． 05\\) 。

與連續3 次服用復方丹參片相比，Beagle 犬單劑量口服復方丹參緩釋片最大血藥濃度由 1． 668 μg/mL 降至 0． 973 μg/mL，達峰時間由 29． 428 min 后移至 81．179 min，消除半衰期從 29． 383 min 延長至 261． 745min; 經方差分析，比較各主要藥動學參數 \\( Cmax、t1 /2、Tpeak\\) ，差異有顯著性\\( P＜0． 05\\) 。

多次口服復方丹參緩釋片與復方丹參片達穩態后，兩者最大血藥濃度分別為 2． 108 μg/mL 與 3． 100μg/mL，達峰時間分別為 83． 080 min 與 21． 418 min，消除半衰期分別為 219． 625 min 與 21． 802 min，波動系數分別為 58． 13%與 125． 48%; 經方差分析，差異有顯著性\\( P＜0． 05\\) 。

采用雙單側 t 檢驗和\\( 1－2α\\) 置信區間法分析，置信區間\\( 90%\\) 為 80% ～ 125%，此時表明 2 種制劑的AUC 等效。與連續 3 次服用復方丹參片相比，Beagle 犬單劑量口服復方丹參緩釋片的相對生物利用度為89．9%;而多次口服復方丹參緩釋片與復方丹參片達穩態后兩者相對生物利用度為 93． 6%; 提示它們之間具有生物等效性; 而單劑量口服素片的 AUC 要明顯小于緩釋片，這可能是由于高濃度丹酚酸 B 在吸收部位飽和造成。劉睿等人的試驗證實，丹酚酸 B 在全腸道吸收良好，且在小腸內無特定吸收部位。不同濃度的丹酚酸 B在小腸的吸收情況為: 低濃度＞中濃度＞高濃度，說明丹酚酸 B 的小腸吸收存在高濃度飽和現象。這也進而為制備復方丹參緩控釋給藥系統提供了必要的生物藥劑學依據。

參考文獻

［1］國家藥典委員會． 中華人民共和國藥典［S］． 一部． 北京:中國科技醫藥出版社． 2010: 904－905．
［2］宋敏，杭太俊，張正行，等． 丹參提取物有效成分在大鼠體內的藥代動力學和相互影響研究［J］． 藥學學報，2007，42\\( 3\\) : 301－307．
［3］黃泰康． 常用中藥成分與藥理手冊［M］． 第 1 版． 北京: 中國伊醫藥科技出版社． 1994: 626．