紫杉醇\\( Paclitaxel\\) 是從紅豆杉屬植物中提取出來的一種具有高效抗腫瘤活性的天然物質.紫杉醇水溶解性較差,臨床應用主要是紫杉醇/聚氧乙烯蓖麻油注射劑,即由乳浮 EL\\( Cremophor EL,含增溶劑聚氧乙烯蓖麻油\\) /無水乙醇\\( 50∶ 50\\) 配制成的無色黏稠狀溶液.
有研究顯示增溶劑聚氧乙烯蓖麻油在體內可促使大量組織胺釋放因而產生過敏反應; 還可溶解聚氯乙烯輸液器中的二乙烯己基鄰苯二甲酸鹽導致嚴重的毒性反應[1].目前納米膠束載藥系統有眾多研究[2],并已研制出不含有增溶劑的紫杉醇載藥納米膠束新劑型[3 -4].
在首度報道合成可生物降解的聚乙二醇-聚谷氨酸芐酯\\( polyethylene glycol- polybenzyl-L-glutamate,PEG-PBLG\\) 兩親型嵌段共聚物,并可作藥物的納米載藥系統之后[5],其作為載藥納米膠束平臺的研究取得較多成果[6 -9].在紫杉醇/PEG-PBLG 納米膠束的研究基礎上[10],制備紫杉醇/PEG-PBLG 納米膠束凍干粉針劑[11].本研究合成表征 PEG-PBLG 測定其高分子嵌段共聚物的細胞毒性,評估紫杉醇/PEG-PBLG 凍干粉針劑對 2 種癌細胞的體外細胞毒性,并與臨床所用的紫杉醇/聚氧乙烯蓖麻油注射劑進行比較.
1 材料與方法
1. 1 材料與儀
器紫杉醇/PEG-PBLG 凍干粉針劑,采用膜透析法制備紫杉醇載藥納米膠束溶液,加入 3%甘露醇冷凍干燥獲得粉針劑\\( 紫杉醇含量 8. 13%\\) ; 紫杉醇,福建南方生物技術股份有限公司,批號 JP050901,純度 99. 2%;紫杉醇注射劑\\( 6 mg/mL × 5 mL\\) ,北京四環醫藥科技股份有限公司; 透析袋\\( 截留 Mw3500 ~ 5000\\) ,上海綠鳥科技發展有限公司進口分裝; RPMI1640 培養基、小牛血清、胰蛋白酶,美國 Gibco 公司; 25 cm2培養瓶、96孔培養板,美國 Corning 公司; 其他試劑均為分析純;HeLa 人子宮黏膜上皮細胞、HO-8910 人卵巢癌細胞、A549 人肺小細胞腺癌細胞,中山大學實驗動物中心提供.Mercury-Plus 300 核磁共振波譜儀,美國 VAR-IAN 公司; 1 - 4 / LSC 冷凍干燥機,德國 CHRIST AL-PHA; CKX41 倒置相差顯微鏡,日本 Olympus; Bio-RADMode 1450 酶聯免疫檢測儀,美國 Microplate Read-er; CO2培養箱,英國 Galaxy R.
1. 2 PEG-PBLG 嵌段共聚物的合成及核磁表征
采用文獻[12]方法合成 PEG-PBLG: 谷氨酸在 60%硫酸催化下先進行 γ-芐酯化、再與二\\( 三氯甲基\\) 碳酸酯作用生成谷氨酸芐酯羧酸酐\\( A\\) ,最后在端氨基聚乙二醇單甲醚\\( I\\) 的引發陰離子聚合反應.在不同 \\( A/I\\) 的摩爾比下聚合反應,可生成不同分子量的 PEG-PBLG 嵌段共聚物.利用1HNMR 獲得 PEG-PBLG 氫核磁譜圖,并根據共聚物的嵌段比,計算出 PEG-PBLG 的分子量.
1. 3 觀察 PEG-PBLG 嵌段共聚物的體外細胞毒性
將處于指數生長期的 HeLa 細胞消化,用 RP-MI1640 培養液調整細胞密度 6 × 104個/mL,實驗前一天接種于24 孔板中,每孔1 mL.5% CO2、37 ℃培養箱培養 24 h,吸取各孔內培養液棄去,加入各實驗組的培養液 1 mL.苯酚陽性對照組,用 RPMI1640 培養液調整苯酚濃度為 6. 4 μL/mL; 陰性對照組用新鮮 RPMI1640 培養液; 溶劑對照組加入增溶劑聚氧乙烯化蓖麻油的 RP-MI1640 分散液,濃度為 2 μL / mL; 實驗組加入 PEG-PBLG 膠束凍干樣品 RPMI1640 培養液分散溶液,膠束濃度為 200 μg/mL.各組設平行樣品 4 個.置細胞恒溫培養箱中培養 24 h,通過倒置顯微鏡觀察細胞形態和生長情況.
1. 4 凍干粉針劑對癌細胞的細胞毒性試驗
分別將處于指數生長期的 HO-8910、A549 細胞消化,用 RPMI1640 培養液調整細胞密度 1. 5 ×104個/mL,實驗前一天接種于 96 孔板中,每孔 200 μL.陰性對照組用新鮮 RPMI1640 培養液交換; 陽性對照組加入用 RP-MI1640 培養液稀釋市售紫杉醇 / 聚氧乙烯化蓖麻油注射劑,紫杉醇濃度分別為 50、20、10、5 μL/mL 溶液\\( 內含增溶劑聚氧乙烯化蓖麻油分別為 10、4、2、1 μL/mL\\) ;增溶劑對照組加入用 RPMI1640 培養液稀釋聚氧乙烯化蓖麻油,濃度分別為 10、4、2、1 μL/mL 溶液; 凍干粉治療組加入用 RPMI1640 培養液分散紫杉醇/PEG-PBLG 凍干粉針劑樣品,配制成紫杉醇含量為 50、20、10、5 μg / mL 溶液,每個試樣復種 4 孔.用 PBS 漂洗細胞 2 次后,將上述各組的培養液覆蓋在培養細胞上,5% CO2、37 ℃培養箱培養 24 h 后,于每孔加入 5 mg/mL 的 MTT 20 μL,繼續培養 4 h,吸盡上液,用 PBS 清洗 2 遍后,每孔加入 DMSO 溶液 150μL,室溫放置 15 ~20 min,振搖 15 min 均勻染色,用酶標儀測定 570 nm 處吸光度值\\( OD\\) .根據\\( 1\\) 式計算細胞相對增殖百分率\\( relative growth rate,RGR\\) ,評定細胞毒性級別[13].RGR = \\( 試樣組 OD 值\\) / \\( 陰性對照組 OD 值\\) × 100%\\( 1\\)
1. 5 統計學方法.
所有數據采用均數 ± 標準差\\( x珋 ± s\\) 表示,計量資料分析采用 t 檢驗,檢驗水準 α =0. 05,P <0. 05 具有統計學意義.
2 結果.
2. 1 PEG-PBLG 嵌段共聚物的合成.
PEG-PBLG 的1H-NMR 如圖 1 所示: a 峰,δ7. 25\\( 苯環 5H\\) ; b 峰,δ5. 04\\( 芐基 2H\\) ; c 峰,δ3. 66\\( 乙氧基峰4H\\) ,以上氫核磁譜圖證實了 PEG-PBLG 共聚物的合成形成.
1HNMR 可測定共聚物的嵌段比,由 PEG 嵌段的單位乙氧基質子峰面積\\( c 峰,δ3. 66\\) 和 PBLG 嵌段的單位芐基質子峰面積比\\( b 峰,δ5. 04\\) 獲得,由于 PEG分子量已知,因此可計算出 PEG-PBLG 的分子量.本實驗采用文獻[12]
方法合成 PEG-PBLG,經測定其分子量 Mw =1. 86 ×104.
2. 2 PEG-PBLG 共聚物對 HeLa 細胞形態的影響000.
HeLa 細胞培養 24 h 后在倒置顯微鏡下觀察: PEG-PBLG 組和陰性組,見圖 2\\( a\\) 、2\\( c\\) ,細胞成長梭形或多角形,折光性強,細胞排列密集,連接成片,可見圓形分裂細胞,其周圍有明亮的暈,表明細胞生長旺盛; 而溶劑組,見圖2\\( b\\) ,細胞生長狀態不好,沒有連接成片而且部分細胞死亡破裂,表現出明顯的細胞毒性; 陽性組\\( 苯酚\\) ,見圖2\\( d\\) ,細胞大量死亡,呈重度細胞毒性.
通過觀察可得: 臨床所用紫杉醇注射劑中增溶劑在較低濃度 2 μL/mL 下就具有較強的細胞毒性,而在PEG-PBLG 在 200 μg / mL 較高濃度下,HeLa 細胞生長情況良好.說明嵌段共聚物 PEG-PBLG 作為高分子材料,對 Hela 細胞毒性較低,安全性較好.
2. 3 凍干粉針劑對癌細胞的細胞毒性實驗.
從圖 3、圖 4 可見,當紫杉醇濃度≥20 μg/mL 時,紫杉醇注射劑的陽性對照組、紫杉醇/PEG-PBLG 的凍干粉治療組在細胞毒性評分均為 4,表現明顯細胞毒性; 而紫杉醇濃度≤10 μg/mL,凍干粉治療組的體外細胞毒性要遠低于紫杉醇注射劑組\\( P <0. 01\\) ; 在含有 1μL/mL 的聚氧乙烯化蓖麻油時,增溶劑組毒性評分為3,因此增溶劑也具有較強的細胞毒性; 臨床所用紫杉醇注射液采用聚氧乙烯化蓖麻油作為難溶藥物紫杉醇的增溶劑,因而由紫杉醇、增溶劑共同構成該制劑的細胞毒性.
3 討論
載藥納米膠束作為一種新型藥物制劑技術,有緩控釋藥物,靶向長效,降低毒副作用,提高療效等諸多優點,具有傳統普通制劑無法比擬的劑型優勢[2].但組成納米膠束的高分子材料用在人體的安全性,則是需要特別關注的研究問題.我國于 1997 年制定了醫療器械生物學評價標準 GB/T1688. 1,生物材料的相容性及其臨床使用的安全性問題越來越受到重視.
目前國內外有多種評價細胞毒性的方法,MTT 法是 1983 年被首次報道使用的一種快速評價細胞增殖和細胞毒性的比色分析法.在測定高分子材料的細胞毒性應用較多的細胞是 1953 年從人類子宮腫瘤中分離出的子宮黏膜上細胞\\( HeLa 細胞\\) ,在 1982 年被美國質量標準協會推薦為細胞毒性試驗中的標準細胞[14].PEG-PBLG 具有優良的血液相容性[15 -16]和生物降解性[17],其親水段為 PEG 已被美國 FDA 批準在人體內使用,不產生毒副作用,無免疫原性[18]; 其疏水段為均聚肽 PBLG,在體內可發生降解成為蛋白質的組分谷氨酸,無蓄積和毒副作用.在本研究中高分子材料 PEG-PBLG 在 200 μg/mL 較高濃度時仍未表現出對 HeLa 的細胞毒性,這充分證明該高分子聚合物的安全性良好.
在紫杉醇/PEG-PBLG 凍干粉針劑對 2 種人癌細胞的細胞毒性實驗中: 當紫杉醇濃度為≥20 μg/mL 時,陽性對照組、凍干粉治療組均表明具有很強的細胞毒性.這有可能是因為 2 組溶液中游離紫杉醇量已達到飽和濃度,飽和藥物濃度對癌細胞抑制殺滅效果是一樣; 而低濃度情況下\\( ≤10 μg/mL\\) ,凍干粉治療組對 2種癌細胞的毒性均明顯低于相同藥物濃度的臨床所用紫杉醇注射劑\\( P < 0. 01\\) ,是因為紫杉醇/PEG-PBLG載藥膠束包埋藥物僅釋放部分紫杉醇,并且無增溶劑的細胞毒性,因而顯著地降低了制劑的細胞毒性.通過本實驗研究可以明確: 紫杉醇/PEG-PBLG 載藥納米膠束可顯著降低紫杉醇制劑在體外的細胞毒性后,從而有可能減少紫杉醇制劑的毒副作用,具有較好的臨床應用價值與前景.但在納米膠束降低抗腫瘤藥物的細胞毒性后,能否保持對腫瘤組織的治療效果,有待藥效學動物實驗的進一步驗證.
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