糖尿病患者動脈粥樣硬化性心臟病的發病率較非糖尿病患者明顯增加， 且呈現加速進展態勢， 其形成的確切機制尚未完全清楚。 研究表明： 糖尿病患者體內晚期糖基化終末產物（advanced glycation end-products， AGE） 的形成和不斷 累積與動脈粥樣硬化的發生和發展關系密切。 動脈粥樣硬化 （AS）病變始于內皮損傷， 而 AGE 可作用于細胞表面特異性受體RAGE （receptor of AGE） ， 使內皮細胞凋亡增多 、 增生減少 ；誘導發生氧化應激， 產生自由基導致氧化損傷、 血管收縮和促凝血狀態、 刺激細胞因子等釋放， 加劇血管壁的炎癥過程發揮其致動脈粥樣硬化的效應。 如何延緩甚至逆轉糖尿病加速 AS的發展進程是近來研究的熱點。 黃芪注射液為中藥黃芪提取物制成的針劑， 其主要成分黃芪多糖 （astragalus polysaccharides，APS） 可雙向調節血糖及增強機體 免疫功能 ， 對糖尿病心血管并發癥如 AS 的發生發展也有一定的保護作用。 本研究旨在觀察體外培養環境下黃芪是否具有保護晚期糖基化終產物誘導內皮細胞凋亡效應的作用及可能的機制。

1、 材料與方法

1．1 主要材料

黃芪注射液由成都地奧制藥公司生產， 規格 1 g／mL。 內皮細胞基礎培養基 （EBM－2） 購于 Lonza 公司。 胎牛血清 （fetalbovine serum， FBS） 購 于 Gibco 公 司 。 ROS 熒光檢測試劑盒（Image－iT LIVE Green ROS Detection Kit） 購于 Molecular Probes公司。 DMSO、 N－乙酰－L－半胱氨酸 （NAC） 購自 Sigma 公司。人凋亡因子 FAS ELISA 試劑盒購于 R＆D 公司。 MTS 檢測試劑盒購于美國 Promega 公司。 其它試劑為國產分析純。

1．2 體外制備晚期糖基化終產物修飾的人血清白蛋白

人血清白蛋白 （HSA） 0．2 g， D－葡萄糖 3．0 g 共溶于 10mL 0．5× 磷酸鹽緩沖液 （PBS） 中 （pH 7．4）， 使 HSA 終濃度為20 g ／ L， D－葡 萄糖為 1．67 mol ／ L， 室 溫下攪拌 5 h， 用 孔徑為0．22 μm 的針頭濾器過濾滅菌后 ， 封裝置于 37 ℃ 恒溫箱孵育90 天后取出， 于 20 mmol ／ L PBS 中充分透析后備用 。 用 Brad-ford 法檢測 AGE 濃度。

1．3 內皮細胞培養

原代人冠狀動脈內皮細胞 （HCAECs） 購于 Cell applica-tions 公司。 培養液為含 10％ FBS 的 EBM－2 培 養基 。 經 0．25％胰蛋白酶和 0．01％的 EDTA 混合液消化 10 分鐘， 離心后用少量培養基重新懸浮， 轉入 5％ CO2培養箱中進行原代培養， 培養3 ～ 4 天 后更換含有 10％的 FBS、 青 霉素 100 u ／ mL 及 鏈霉素100 u ／ mL 的 EBM－2 培養液， 待細胞生長融合達 80％后， 胰酶消化、 傳代。 取第 3 ～ 4 代細胞用于實驗研究。

1．4 細胞增殖測定

按照美國 Promega 公司 MTS 檢測試劑盒說明書操作。 收集處于對數生長期的細胞， 以含 10％的胎牛血清的 EBM－2 培養基稀釋至 1 × 105／ mL， 接種至 96 孔細胞培養板， 每孔接種 0．1mL 培 養過夜 ， 使細胞貼壁 ， 按既定方案分組 ， 孵育 24 h 后 ，每孔加入 20 μL 的 MTS 溶液， 37 ℃， 5％ CO2培養箱溫育 4 h，用酶標儀測定 490 nm 波長處的吸光值， 計算細胞增殖率。

1．5 激光共聚焦檢測細胞內氧自由基 ROS 變化

按照 Image－iT LIVE Green Reactive Oxygen Species Detec-tion Kit 說明書操作 。 簡要操作方法 ： 移除細胞培養基 ， 37 °CPBS 中 清洗細胞 3 次 ， 每 次 5 分 鐘 ， 防止細胞脫落 ； 配制 25μM carboxy－H2 DCFDA ＋ 1．0 μM Hoechst 工 作液 ， 300 μL 覆 蓋細胞， 濕潤環境下培育 30 分鐘， 室溫， 避光。 在 PBS 中清洗細胞 3 次， 每次 5 分鐘。 甘油封片， 激光共聚焦顯微鏡檢測。

1．6 FAS ELISA 檢測

取各組細胞培養液上清用于 FAS 檢測。 操作按 R＆D 公司FAS ／ CD95 ELISA 試劑盒說明， 用酶標儀在 450 nm 波長依序測量各孔的光密度 （OD 值）。 每次實驗每組設 3 個復孔， 重復 3次。 用 Curve Experts 1．3 軟件算出對應濃度。

1．7 統計學分析

實驗結果用均數 ± 標準差表示， 采用 SPSS 18．0 統計軟件包進行單因素方差分析， 以 P ＜0．05 為差異有顯著性。

2、 結果

2．1 黃芪對 AGEs 誘導內皮細胞凋亡的影響

將 HCAECs 以 2 × 106細胞 ／mL 接種至 60 mm 培養皿中，將培養至融合狀態的細胞分組： 正常對照組、 AGE 損傷組 （終濃度為 5、 10、 20、 40 mg／L）。 經過單因素方差分析發現： 與空白組相比， 終濃度為 5 mg／L AGE 即可使細胞明顯損傷 （P ＜0．05） （圖 1A）。 選擇損傷較明顯的 AGE 20 mg ／ L 組 ， 30 min后予加低、 中、 高濃度黃芪干預 （其中 APS 終濃度分別為100、 200 和 400 mg ／ L）。 結果表明： 與 AGE 20 mg ／ L 組相比 ，中、 高濃度黃芪組細胞存活明顯升高， 經統計有顯著差異 （P＜0．01） （圖 1B）。

2．2 黃芪通過抑制 AGEs 誘導的內皮細胞氧化應激

如圖 2 所示： 與對照組 （A） 相比， AGE 可明顯誘導 ROS水平 （B）， 但其作用可被黃芪注射液抑制 （C）。

2．3 黃芪多糖對人凋亡相關因子 FAS 水平的影響

如圖 3 所示： AGE 20 mg／L 組 FAS 水平明顯升高， 中濃度黃芪組即可降 AGE 誘導 FAS 的水平 （P ＜0．05）； 在 400 mg／L濃度最明顯， 且與 ROS 通路抑制劑 30 mM NAC 組比較， 差異無顯著性 （P ＞0．05）。

3、 討論

血管內皮細胞在血管穩態平衡中有重要作用， 易受到炎性介質損傷引起血管內皮功能障礙。 內皮細胞凋亡是動脈粥樣硬化形成的早期始動環節， 如何早期、 有效保護內皮細胞凋亡，對于延緩甚至逆轉動脈粥樣硬化的發生發展具有重要的臨床意義。 本實驗研究發現： AGE 修飾的人血清白蛋白可以誘導血管內皮細胞凋亡， 呈濃度依賴， 而中、 高濃度黃芪多糖可以抑制該作用； 黃芪多糖可下調 AGE 誘導的 ROS 水平； AGE組可促使血管內皮細胞 FAS 分泌明顯升高， 中、 高濃度黃芪多糖可降低 AGE 誘導 FAS 的水平， 在 400 mg／L 濃度最明顯， 且與 ROS 抑制劑 NAC 比較差異無顯著性。

大多糖尿病患者只關注血糖的水平， 而對危害較大的糖尿病血管并發癥卻未有足夠的重視。 糖尿病血管并發癥的發病機制較為復雜， 存在多個環節和靶點， AGE 及其受體 RAGE 可能是加速動脈粥樣硬化進展的關鍵環節， 其具體機制可能與促進內皮功能不全、 誘導的血管內皮通透性增加、 促單核細胞遷移入血管內膜、 誘導內皮祖細胞凋亡和抑制其遷移、 促進氧化應激因子的過表達、 特別是增加內皮細胞的凋亡等有關。 細胞凋亡是受細胞內基因及細胞外因子調控的一種細胞主動死亡方式。 人凋亡相關因子 FAS 被稱為死亡受體， 廣泛表達于機體多種組織細胞表面， 發揮著促進細胞凋亡的作用， 是當前在細胞凋亡實驗中應用較廣泛、 作用較明確的指標， 其高表達可促進細胞凋亡的發生。 本研究亦證實較高濃度的 AGE 可導致內皮細胞凋亡， 并上調 FAS 的表達。

黃芪注射液為中藥黃芪提取物制成的針劑， 主要成分為黃芪皂甙、 黃芪多糖、 氨基酸等， 具有多成分與多靶點作用的特點。 我們既往研究表明， 黃芪多糖可以通過抑制絲裂素活化蛋白激酶磷酸酶－1 （MKP－1） 及單核細胞趨化因子－1 （MCP－1）水平的增高， 逆轉高糖導致的血管平滑肌增殖。 此外亦有研究表明黃芪可以增加高葡萄糖培養的 EPCs 數量及改善其增殖能力， 并能減輕高葡萄糖對 EPCs 向內皮細胞系分化的抑制作用， 可 以通過阻斷 ROS、 NF－κB 途徑抑制腫瘤壞死因子（TNFα） 誘導的黏附因子 ICAM－1 及 VCAM－1 表達。

我們的研究表明， 黃芪可以通過 ROS 通路降低 AGE 誘導凋亡相關因子 FAS 的水平， 有望提供了一條臨床防治糖尿病血管并發癥的新途徑及理論基礎。