射干合劑\\( SGHJ\\) 的臨床療效主要為宣肺清熱,止咳祛痰平喘; 從目前已知的化學成分來分析,鹽酸麻黃堿具有平喘功效,SGHJ 指紋圖譜分析[1]可看到,SGHJ 的可測定化合物主要為鹽酸麻黃堿和黃酮類化合物,本實驗在多指標成分測定方法[2],動物血藥濃度測定[3],SGHJ 多指標成分在體內回收率的基礎上,采用給大鼠灌胃 SGHJ 并觀察其主要指標成分鹽酸麻黃堿在動物血清中 24h 濃度變化.目前,對 SGHJ 的臨床療效與指標成分濃度之間的研究還缺乏研究,本研究嘗試在中藥復方制劑的質量控制中引入指標成分的含量與臨床療效相關性的可能性; 為中藥復方制劑的質量控制建立定量基礎.
1 材料
1. 1 儀器與試劑
Agilent 6460 串聯四極桿質譜,Agilent1200 高效液相色譜儀\\( 美國惠普公司\\) ; Labofuge 400R 高速離心機\\( 上海力新有限公司\\) ; XW-80 型旋渦混合器\\( 原上海醫科大學儀器廠\\) ; Olympus BX50 光學顯微鏡\\( Olympus 公司\\) ; pHS-3TC 精密數顯酸度計\\( 上海天達儀器有限公司\\) ; 電熱恒溫鼓風干燥箱\\( 上海躍進醫療器械廠\\) ; As3120B 超聲波清洗器\\( 上海醫用分析儀器廠\\) .
鹽酸麻黃堿對照品 \\( ephedrine hydrochloride,ED; 批號: 171241-201007; 含量: 99. 7% \\) 、內標\\( IS\\)鹽酸硫利達嗪對照品 \\( thioridazine hydrochloride,TD; 批號: 100344-201002; 含量: 95. 2% \\) 均購自中國食品藥品檢定研究院; 射干合劑 \\( SGHJ,批號:111201,上海美優制藥廠\\) ,規格: 100ml / 瓶; 甲醇、乙腈\\( 色譜純,美國 Tedia 公司\\) ; 水為雙蒸餾水,其余試劑均為分析純; 全部溶劑均采用0. 22 μm微孔濾膜過濾.
1. 2 實驗動物
清潔級 SD 大白鼠,體質量約\\( 250 ± 23\\) g,雄性; 實驗前適應性飼養 3 d,動物房溫度保持在 19 ~25℃ ,6: 00 ~ 18: 00 光照,18: 00 ~ 6: 00 黑暗交替.實驗前12 h,動物禁食供水,由上海交通大學醫學院附屬新華醫院實驗動物中心提供,實驗動物使用許可證號: SYXK \\( 滬\\) : 2008-0052; 生產許可證號:SCXK\\( 滬\\) 2004-0001; 空白血清、尿液、糞便均采自未服用目標物的動物.
2 方法與結果
2. 1 樣品測定及方法學考察
2. 1. 1 色 譜條件 分 析 柱: Capcell C18MGIII[2. 0 mm ×100 mm,5 μm,資生堂\\( 中國\\) 投資有限公司]; 流動相 A: 水,流動相 B: 乙腈,二元線性梯度洗脫[0 ~ 0. 5 min,A: B\\( 95%: 5%\\) ; 0. 5 ~ 5 min,A: B\\( 10% : 90% \\) ; 5 ~ 6. 5 min,A: B \\( 95% : 5% \\) ,6. 5 ~ 10 min,A: B \\( 95% : 5% \\) ]; 流 速: 0. 3 ml ·min- 1; 進樣體積 5 μl.
2. 1. 2 質譜條件 電噴霧離子源,正離子掃描; 霧化氣: 50 kPa,氣簾氣: 20 kPa,碰撞氣: 48 kPa,離子源電壓: 4 500 V,離子源溫度: 500℃,為正離子多離子反應監測\\( MRM\\) 掃描方式.在上述色譜、質譜條件下,通過質譜參數優化,分別得到 ED 和 IS\\( TD\\)的離子選擇通道分別為 m/z 166. 2 →148. 2、m/z371. 2→126. 2.見圖 1.
2. 2 標準溶液的配制
分別精密配制 ED、IS 標準品配制質量濃度為0. 1 mg·ml- 1的標準儲備液,儲存于 -20℃備用; 各對照品的工作液濃度: 0. 1 μg·ml- 1.
2. 3 空白血清及含藥血清樣品的預處理
2. 3. 1 血清的預處理 取大鼠空白、含藥全血0. 3 ml在 3 000 r·min- 1條件下離心 10 min,取 45μl 上層血清,加 IS 5 μl 混勻,加甲醇 150 μl,旋渦振蕩,離心3 000 r·min- 1,上清液10 μl 加50 μl 水稀釋,渦旋混合 3 min,取 5 μl 進樣.
2. 3. 2 尿液 取空白、給藥尿樣,用甲醇稀釋 10 倍體積,離心,然后取 IS 10 μl\\( 0. 1μg·ml- 1\\) ,加 10μl 稀釋尿液,再加水 80 μl,混勻,取 5 μl 進樣.
2. 3. 3 糞便 稱取空白、糞樣約0. 1 g,加 1 ml 甲醇,超聲處理\\( 500 W,40 kHz\\) 30 min,離心,然后取100 μl 內標\\( 0. 1 μg·ml- 1\\) ,加稀釋液5 μl,再加水895 μl,混勻,進樣,最終濃度相當于稀釋 200 倍.
2. 4 實驗方案將 8 只大鼠分為兩組,6 只為試驗組,2 只為對照組; 對照組大鼠禁食供水 12 h,分別灌胃蒸餾水1. 0 ml /100 g; 實驗組大鼠禁食供水 12 h,分別灌胃SGHJ 1. 0 ml /100 g,大鼠分別放入代謝籠中,分別在給藥后不同的時間靜脈采血0. 3 ml; 兩組大鼠均在給藥前和給藥后0. 5,1. 0,1. 5,2. 0,4. 0,6. 0,8. 0,12. 0,18. 0,24. 0 h經大鼠眼球后靜脈叢采集靜脈血0. 3 ml,收集于普管中,4 000 r·min- 1離心 10 min,分離血清; 按"2. 3"項下方法處理后,保存于 -20℃待測; 兩組大鼠均在給藥前和給藥后 1,2,4,6,8,10,12,14,18,24 h 收集尿液,按"2. 3. 2"項下方法處理尿液; 在 4,8,12,16,20,24 h 收集糞便,按"2. 3. 3"項下方法處理糞便.
2. 5 SGHJ 中 ED 的含量測定
取 SGHJ 1 ml 加甲醇至 10 ml,混勻,離心,取上清液 100 μl,用雙蒸餾水稀釋至 1 ml,混勻,然后取10 μl IS\\( 0. 1 μg·ml- 1\\) ,加稀釋液 10 μl,再加 80μl 水,混勻,0. 22 μm濾膜過濾,進樣體積 5 μl; 將測定值代入各自標準曲線,得到 SGHJ 中 ED 的含量為375. 00 μg·ml- 1.
2. 6 方法學考察
2. 6. 1 標準曲線制備 分別取空白血漿、尿液、糞便加入不同濃度的 ED,按"2. 3"項下方法處理后,進樣,其標準曲線的回歸方程 Y = 9. 536 × 10- 3+5. 253 × 10- 3X,r = 0. 998 9,線性范圍: 0. 05 ~ 50. 00μg·ml- 1,最低檢測限為0. 05 ng·ml- 1.
2. 6. 2 方法的專屬性 空白血清、尿液、糞便中無ED 和 IS 峰出現,證明空白樣品不干擾本方法的測定.
2. 6. 3 方法的精密度與準確度 用空白血清、尿液、糞便配制 ED 加 IS 高、中、低 3 個濃度\\( 0. 05、5. 00、25. 00 mg·L- 1\\) 的質量控制樣品,每一濃度進行 6 樣本分析,連續測定 3 d,結果表明 ED 的日間和日內精密度≤7. 6%,準確度在≤5. 4%.
2. 6. 4 提取回收率 同"2. 6. 3"項下操作,用空白血清、尿液、糞便配制 ED 加 IS 高、中、低 3 個濃度\\( 0. 05,5. 00,25. 00 mg·L- 1\\) ,同時用水配制相應濃度的回收率 100%樣品.每一濃度均進行 5 樣本分析,按樣品與水中相應物質面積比得到計算回收率在0. 05 mg·L- 1濃度時平均回收率為\\( 94. 2 ±2. 1\\) % ,在 5. 00 mg · L- 1濃度時平均回收率為\\( 93. 4 ±3. 2\\) %,在25. 00 mg·L- 1濃度時平均回收率為\\( 95. 3 ±4. 1\\) %.
2. 6. 5 樣品的穩定性考察 取空白血清、尿液、糞便,同"2. 6. 3"項下操作,配制 ED 加 IS 高、中、低 3個濃度的質量控制樣品\\( 0. 05,5. 00,25. 00 mg·L- 1\\) ,考察穩定性,每一穩定性考察進行 6 樣本分析.結果表明 ED 血清樣品經歷 3 次冷凍、解凍循環后室溫放置 24 h,3 個濃度樣品均穩定\\( RSD≤4. 5% \\) .
2. 7 大鼠血中 ED 濃度變化按"2. 4"項下實驗方案,給實驗組大鼠灌胃SGHJ 1 ml /100 g,在給藥后不同時間靜脈采血0. 3 ml,按"2. 3"項下方法處理后,檢測大鼠血清樣品中 ED 含量.以采血時間為橫坐標,ED 血濃度為縱坐標繪制藥時曲線,灌胃給藥后藥時曲線見圖 2.
應用《藥代動力學參數計算及其臨床應用》統計軟件程序\\( PK-Graph\\) ,分別對上述血藥濃度測定數據進行擬合并計算其藥物代謝動力學參數,結果見表 1.
2. 8 大鼠尿液及糞便中 ED 濃度變化
按"2. 4"實驗方案,測得 ED 大鼠在尿中 24 h可基本排泄完,結果見圖 3.糞便中未能測定 ED.
3 討論
中藥的活性成分研究方法目前有血清藥物化學法[4],活細胞萃取技術[5],代謝組學[6],本文對SGHJ 采用灌胃方法,測定可入血活性成分,通過實驗證明 ED 可被大鼠吸收進入血液,且 ED 在吸收進入體內 24 h 基本從尿中回收,糞便中不能測得.這一現象說明: ①ED 在體內基本不經過肝膽循環; ②ED 在體內很少蓄積,很快排出體外,與文獻報道一致[7,8],且與文獻報道人體在服用麻黃堿后 24 h 檢測到麻黃生物堿量基本相符[7 ~9],說明在服藥 24 h后大部分麻黃生物堿隨尿排出.
本實驗 ED 的達峰時間為1. 33 h,文獻[7]為 2h,文獻[8]為0. 66 h,可能與復方中藥成分影響麻黃堿的藥動學參數有關[10],還需進一步證實.對 ED尿中 24 h 排泄率不同的文獻[7 ~9]報道也有區別,但影響不大.
參 考 文 獻.
1 唐躍年,金梁,張青,等. 射干合劑的 HPLC-UV 指紋圖譜分析[J]. 中國臨床藥學雜志,2012,21\\( 5\\) : 283-286
2 唐躍年,金梁,張青. HPLC 法測定射干合劑中多指標成分的含量[J]. 中國臨床藥學雜志,2010,19\\( 4\\) : 233-336
3 唐躍年,陳婷,魏昕,等. LC-MS / MS 法測定動物血清中射干合劑多指標成分的濃度[J]. 中國藥師,2013,16\\( 2\\) : 190-193
4 常存庫,王喜軍. 中藥血清藥物化學理論與方法的意義[J]. 世界科學技術---中醫藥現代化,2010,12\\( 4\\) : 635-637
5 董倩倩,李萍,聞曉東. 丹參成分在 Caco-2 細胞中吸收的研究[J]. 中國天然藥物,2007,5\\( 1\\) : 59-62
6 王喜軍. 基于藥物代謝組學的中藥及方劑中組分間協同增效作用[J]. 中國天然藥物,2009 ,\\( 7\\) 2: 90-94
7 賀豐,羅佳波,陳飛龍,等. GC-MS 法研究麻黃湯中麻黃堿、偽麻黃堿的人體內過程[J]. 中藥新藥與臨床藥理,2004,15\\( 5\\) : 336-347
8 龍銳. 小青龍顆粒中麻黃堿_偽麻黃堿在大鼠體內的藥動學及藥效學研究[D]. 北京: 北京中醫藥大學碩士學位論文,2008
9 陳燕,朱全紅,羅佳波,等. 麻黃湯中麻黃生物堿在人尿中的排泄研究[J]. 中國實驗方劑學雜志,2007,13\\( 11\\) : 55-60
10 沈群. 麻黃湯不同配伍對麻黃堿和偽麻黃堿在小鼠體內藥代動力學的影響[D]. 廣州: 第一軍醫大學碩士學位論文,2002
