甘丙肽\\(GAL\\)是近年來發現的一種神經肽,其N和C端分別為甘氨酸和丙氨酸殘基[1].根據其分子結構分析,GAL可能是區別于其他家族而獨立存在的一種神經肽,它廣泛存在于外周神經系統和中樞神經系統中,具有促進生長激素和縮宮素釋放、調節消化和生殖系統平滑肌收縮、抑制胰島素分泌等生理功能[2-3].下丘腦-垂體-睪丸軸是調控雄性生殖功能的主要通路,有研究報道,GAL可增強促性腺激素釋放激素\\(GnRH\\)作用,促進黃體生成激素\\(LH\\)分泌,提示GAL可能通過中樞調控參與下丘腦-垂體軸的功能調節[4].但國內外有關GAL在睪丸、附睪的表達及其對雄激素產生和精子發生調控作用的研究報道較少.因此,本研究旨在探討GAL在嚙齒類動物睪丸、附睪組織中有無表達,明確其定位,為進一步研究GAL在雄性生殖系統中的功能提供理論依據和實驗資料.
1材料與方法
1.1動物
10只SPF級C57雄性健康小鼠,體重\\(20~24\\)g,12周齡,由維通利華實驗動物研究所提供,常規飼養,動物許可證號:scxk-\\(京\\)2012-0004.
1.2試劑
GAL一抗購自英國Abcam公司;SP試劑盒和二氨基聯苯胺\\(DAB\\)顯色試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術有限公司;其余試劑為國產分析純.
1.3組織標本的采集與處理
斷頸處死動物,取出睪丸和附睪組織,迅速投入Bouin's液固定,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片3μm,免疫組織化學染色在標本收集后4周內完成.
1.4免疫組織化學染色
組織石蠟切片脫蠟至水后,3% H2O2孵育15min消除內源性過氧化物酶的活性,1% Triton X-100浸泡15min增加組織穿透性,5%正常羊血清室溫封閉25min后,滴加一抗\\(1：1000\\),4℃過夜.恢復室溫40min,0.01mol/L\\(pH 7.2~7.4\\)PBS洗2次,5min/次;滴加生物素化二抗,37℃孵育1h,PBS洗2次,5min/次;滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素,37℃孵育25min,PBS洗2次,5min/次;加DAB顯色液作用2~5min,終止反應,雙蒸水充分洗滌;常規脫水、透明、封片.以緩沖液替代一抗為陰性對照,以海馬組織為陽性對照.光鏡下觀察,細胞質或細胞核中呈現棕黃色顆粒為陽性.
2結果
在睪丸組織中,GAL免疫陽性染色定位于間質細胞、支持細胞和各級生精細胞\\(包括精原細胞、初級精母細胞和精子細胞 \\),主要表達于胞膜及胞質\\(圖1-A\\).在附睪組織中,GAL陽性染色主要表達于附睪管高柱狀細胞、低柱狀細胞的胞膜及胞質,附睪管上皮的亮細胞、暈細胞及基細胞未見陽性表達,附睪間質也為陰性\\(圖1-B、C、D\\);GAL在附睪體和尾部表達較強,在頭部遠段表達較弱.圖1-E為睪丸陰性對照,圖1-F為海馬陽性對照.
3討論
GAL是Tatemoto于1983年從豬小腸提取物中發現的一種29肽,目前對GAL的研究主要集中在神經系統和內分泌系統.研究表明,GAL的mR-NA在大鼠和小鼠的下丘腦和腦干區域含量最多,并且GAL和多種傳統神經遞質及神經肽共存[5-6].
低濃度GAL腦室注射可促進GnRH釋放,且GAL可通過其受體直接作用下丘腦GnRH神經元,促進LH分泌,提示GAL可能在下丘腦-垂體-生殖軸方面發揮重要生理作用[7-9],但GAL在雌雄動物生殖器官表達和定位尚無報道.本實驗結果顯示,GAL在睪丸間質細胞中有表達.間質細胞是具有分泌類甾體激素功能的細胞,間質細胞分泌的雄激素有促進精子發生、促進男性生殖器官的發育與分化以及維持第二性征和性功能等作用.推測GAL可能參與了睪酮的分泌過程.
GAL在支持細胞,生精細胞呈陽性表達,推測GAL在精子生成過程中可能發揮作用.此外,本實驗結果顯示,GAL在附睪有表達,提示附睪組織可能具有合成GAL的能力,調節其自身的吸收和分泌功能,進而影響附睪管腔液的組成及精子成熟的微環境,參與精子的睪丸后成熟.
本文研究了GAL在小鼠睪丸、附睪的表達定位和特點,提示它們可能以自分泌或旁分泌的形式共同調節睪丸和附睪的微環境,影響精子的發生、發育和成熟,但要完全闡明它們在雄性生殖中的作用仍需深入研究.本文證明了GAL在小鼠睪丸和附睪組織中的廣泛分布,為今后研究GAL在小鼠生殖系統的功能奠定了基礎.
參考文獻
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