在千百年的醫療實踐中, 中國醫家發現了人體體表與體表、體表與內臟之間存在上下內外特定聯系的規律, 古人創立了經絡學說來解釋這一重大發現并指導臨床實踐, 時至今日對針灸臨床仍然具有重要的指導作用[1]. 但是, 經絡學說所揭示的體表與體表兩點間聯系的研究長期以來未得到重視, 而“經脈所過, 主治所及”的遠端取穴的這種針灸學主要原則的機理問題一直沒有得到解決[2].
手陽明大腸經起于食指端, 沿上肢橈側上行, 終于同側口面齒部. 元代王國瑞撰寫的《扁鵲神應針灸玉龍經》\\(1329 年\\)以歌賦形式“頭面縱有諸樣癥, 一針合谷效通神”, 確立了位于拇食指虎口部合谷穴與頭面部的關系. 由明代朱權\\(1378~1448 年\\)所撰的《乾坤生意》\\(1406 年\\)一書, 簡括為“面口合谷收”一語;后被《針灸聚英》、《針灸大全》、《楊敬齋針灸全書》、《針灸大成》等作為《四總穴歌》收入書中. “面口合谷收”是指位于手陽明大腸經的“合谷穴”能有效治療大腸經遠端循行所過部位“面口部”的疾患\\(如牙痛、面神經麻痹等\\), 但位于前肢手腕部的合谷穴區與顏面部有如此長距離的空間阻隔, 其聯系的生物學機制是什么? 探尋合谷穴與口面部的特異性聯系規律及其途徑, 不僅可以詮釋經絡學說的科學內涵以豐富和發展經絡學說, 而且將進一步闡明穴位主治作用的規律和實質, 對提高針灸臨床療效具有重要的指導作用.
Penfield 腦皮層位域圖問世以來, 人們注意到口面部與手指在感覺和運動皮層的位置相互接壤[3]. 隨著近年來大型數字化腦成像系統和腦在體多通道神經電生理技術的發展, 從現代神經信息的傳遞和影像學研究來闡述腦的感覺和運動皮質、皮質下中樞和丘腦與外周傳入的空間立體定位關系, 得到了不少新穎的資料[4~8]. 這些研究技術為解決經脈體表與體表上下之間的特定聯系提供了神經信息空間定位處理、整合方面的寶貴經驗[9].
本研究采用電生理技術探討來自口面部和手部的軀體感覺傳入在成年恒河猴\\(Macaca mulatta\\)感覺皮層神經元的位域關系, 在腦科學層面闡述“面口合谷收”的神經機制.
1 材料與方法
1.1 研究對象成年恒河猴 4 只\\(雌性 1 只, 雄性 3 只\\), 由廣東省高要市康達實驗動物科技有限公司\\(廣州\\)提供, 年齡為 5~7 歲, 體重為 5~7 kg\\(實驗動物合格證編號: SCXK\\(粵\\)2009-0025\\). 實驗期間對動物的處理符合《實驗動物管理條例》\\(1988\\)及 2006 年科學技術部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》的規定, 并得到廣州中醫藥大學動物實驗倫理委員會的批準.
1.2 動物麻醉實驗開始前, 所有動物均禁食 24 h. 氯胺酮和速眠新\\(3:1\\) 0.2 mL 誘導麻醉, 隨后 3%戊巴比妥鈉3 mL 肌肉注射維持麻醉. 麻醉狀態保持在神經外科2 級麻醉水平, 此時猴已經失去知覺, 反射活動減少,對疼痛及其他手術過程的刺激不發生反應. 在動物出現較為明顯的肌肉收縮反應時補充 1/10 劑量的戊巴比妥鈉. 動物自主呼吸, 經股靜脈持續給予葡萄糖生理鹽水\\(8 mL kg-1h-1\\), 維持體溫恒定.
麻醉后將恒河猴俯臥位, 頭部置于大動物腦立體定位儀\\(SR-6R, NARISHIGE, 日本\\)上, 將猴的上門齒置于特制牙托上固定, 以保持呼吸道通暢.
1.3 電生理實驗手術頭頂皮膚消毒后沿矢狀面切開皮膚, 剝離皮下組織至顱骨表面, 用雙氧水反復擦拭顱骨表面, 骨蠟止血. 高速顱鉆鉆孔, 形成約 1.2 cm×1.2 cm 的骨窗,剝離硬腦膜和軟腦膜, 充分暴露前頂葉, 以相對狹長的中央溝\\(central sulcus, CS\\)作為第一軀體感覺皮層\\(SI\\)的標志\\(圖 1\\).
1.4 感覺皮層電生理記錄將絕緣鎢絲電極\\(1 M?, Microprobe, 美國\\)或陣列電極\\(16通道, 2×8\\)固定在微縱作器上, 在體視顯微鏡下由電動推進器\\(DMA-1511, NARISHIGE, 日本\\)將其緩慢推進至記錄部位, 然后以石蠟油覆蓋在腦表面以防止組織干燥并減少機械位移的影響. 待記錄到穩定的神經元自發活動后, 分別觸摸或針刺軀體各部位, 特別注重面口部和手的拇食指, 觀察其對該神經元的誘發反應, 勾劃出這些神經元的外周感受野. 神經元的放電信號經前置放大器輸入多通道神經信號記錄與分析系統\\(Cerebus, 美國\\)或生理信號高速數據采集分析系統\\(SpikeⅡ, CED, 英國\\)進行分析處理. 在此基礎上, 進一步用 von Frey 毛進行感受野敏感度的定量分析和感受野大小定位探查. 以刺激引起的放電反應頻率變化超過 50%的作為感受野相關神經元, 否則, 即界定為靜態神經元.
動物在急性實驗結束后, 將有機玻璃片加工成切除的顱骨形狀并與顱骨縫合, 然后縫合頭皮, 消毒包扎. 術后 7 天給予抗生素以防止感染.
1.5 外周神經橫斷術在記錄和繪制完感覺皮層 3b 區神經元的電生理學研究后, 在動物手腕橈側端縱向切開皮膚, 根據解剖學位置分離出正中神經和橈神經, 用縫合線結扎每根神經, 然后皮膚清創縫合包扎, 并作消炎處理.
1.6 記錄部位形態學定位在電生理記錄結束后, 經靜脈注射 3%戊巴比妥鈉對實驗動物進行深度麻醉并進行心臟灌流. 首先灌入 0.9%生理鹽水 1000 mL, 再灌入 4%多聚甲醛磷酸緩沖液\\(phosphate buffered solution, PBS, pH 7.4\\)1000 mL, 然后取出腦組織并浸泡在含 25%蔗糖 PBS中再放于 4℃恒冷箱中保存. 待腦組織下沉后, 進行形態學分析. 先將記錄區域的皮層組織從整腦分離下來并修成組織塊\\(約2 cm×2 cm×2 cm\\), 然后用平推式冰凍切片機\\(Thermo, Microm HM430, 德國\\)沿垂直于腦中央溝的方向進行連續切片, 厚度為 40 μm,并依次收集、存放于盛有 0.1 mol/L PBS\\(pH 7.4\\)的 6孔培養皿中. 組織切片用神經示蹤尼氏熒光染色法\\(neuro trace fluorescent nissl stains; Invitrogen-MolecularProbes, Eugene, 美國\\)進行組織化學染色. 先將組織切片放入含0.3% Triton X-100 的0.1 mol/L PBS中孵育 1 h, 然后移入內含熒光尼氏染料\\(1:1000; N-21480,Invitrogen-Molecular Probes\\)和 0.1% Triton X-100 的0.1 mol/L PBS 中, 再放入孵育盒內在室溫下孵育 1 h.
操作過程中注意避光. 染色結束后, 用0.1 mol/L PBS將組織切片清洗 3 次, 然后裱貼在陽離子載玻片上.觀察前滴加 50%的甘油后用蓋玻片封片.
1.7 數據分析實驗結束后在記錄腦組織部位經微電極尖端通以微電流\\(10 μA, 10 s\\)電解損毀作為標記, 將感覺皮層 3b 區記錄的感受野相關神經元的位置和深度與外周感受野的分布繪制出相關皮層-感受野構筑的位域圖\\(somatopography\\), 界定口面部-手部拇指\\(特別是“合谷”穴區\\)在腦中的相關聯系.
2 結果
2.1 感覺皮層 3b 區神經元的電生理學記錄采用單電極記錄 2 只恒河猴 3b 皮層神經元活動,尋找外周感受野位于手面交界邊緣腦區的位置, 觀察神經元對手部和面部觸覺刺激的反應形式和位域特征, 闡述“面口合谷收”的腦位域毗鄰關系.
在這 2只恒河猴的 3b皮層進行了 12個通道的探查, 共記錄到 283 個神經元, 其中絕大多數神經元可以在體表部位找到明確的感受野. 進一步對感受野明確、觸覺刺激激活反應超過 50%的 163 個神經元進行了外周感受野大小、刺激閾值、神經元活動特征的分析.
圖 2 顯示, S-17 猴 3b 區 9 通道所記錄到的 15 個神經元, 其外周感受野分布在對側手腕部的橈側和口面部. 通過大面積的皮膚刷毛和/或敲擊刺激, 這15 個神經元的自發性背景活動一般都很低, 多在 5Hz 以下, 甚至 30%左右的神經元無自發活動. 對感受野的刺激都發生超過自發活動 50%以上的激活,大于 1/2 的激活甚至超過 100%或以上; 如果觸覺刺激施加在感受野中心, 其中 6 個神經元的激活呈爆發性, 刺激停止, 神經元的激活多在 1~3 s 內恢復. 采用 von Frey 方法分析了外周感受野的面積. 一般說來,手的掌面、背面和面頰部的感受野稍大, 面積為 2~8 cm2; 拇食指和唇部的感受野為 1~3 cm2; 指尖感受野最小, 為 1~1.5 cm2. 感受野的大小可能與功能的精細程度有關. 3b區神經元對感受野的輕敲和刮擦刺激反應最敏感; 相反, 重壓、針刺引起的激活反應不如中等程度的觸覺刺激明顯. 感受野可以清楚地分為中心區和周邊區, 中心區對刺激反應最敏感; 而且,只有在這個區域才對針刺發生較為明顯的激活反應.
圖 3 記錄的是 S-06 猴 3b 區 3 通道 6 個神經元的外周感受野分布范圍和激活特征. 其中神經元 2 的外周感受野分布在食指根部, 神經元 7 分布在拇指和拇食指的合谷穴區, 神經元10和15分布在面頰和下唇,感受野的觸覺刺激可以明顯激活這些神經元的活動.
有意思的是, 在這個通道記錄到 2 個雙感受野的會聚神經元 9 和 12, 它們的感受野分別位于手掌的魚際-合谷穴區及面部的下唇和下頜, 這種神經元的外周感受野普遍較大, 神經元對感受野刺激的激活程度也很強. 當然, 這類會聚神經元并不多見, 在本研究用單電極記錄分析的 163 個手-面結合部的神經元中,僅觀察到 8 個\\(4.91%\\).
2.2 感覺皮層 3b 區神經元的陣列電極記錄和位域圖的繪制對 3 只動物采用陣列電極記錄方法, 探討了 3b皮層\\(大腦皮層 3b 區\\)外周感受野分布的排序和皮層神經元的位域特征, 闡述合谷穴區和口面部與 3b 皮層神經元位域的相互毗鄰關系. 3b區沿中央溝的后緣形成一個中間外側條帶, 對側體表的軀體感覺傳入在 3b 區有序地排列, 由內到外依次是足、腿、軀干、手臂、手和面[10].
手部區域的外側始于頂內溝末端, 面部位域從三叉神經支配的口周起始, 并與拇指部接壤, 但邊界清楚. 根據 Jain 等人[11]的工作, 通過皮質髓鞘染色可以在組織切片中加以區分.
如圖 4 所示, 采用 2×8 的 16 通道陣列電極在S-11 猴 S1 皮層的記錄實驗中, 通過大面積的皮膚刷毛和/或敲擊刺激, 可以記錄到明確的神經元群活動,一旦刺激停止, 神經元的激活多立即恢復. 采用 vonFrey 方法, 可以精確分析單一電極區細胞的活動和感受野的分布, 在拇指和口唇-下頜部也存在雙感受野刺激發生反應的單位\\(圖 4 中手-面交接部有 5 個共同感受野單位\\).
陣列電極勾畫的軀體傳入在 3b 皮層的位域圖表明, 軀體傳入與頭面部傳入有明確的界線. 手臂的傳入基本上是拇指與顏面部的下唇/下頜相毗鄰, 依次為中指、食指、無名指和小指、臂部、肩部和軀干.
2.3 外周神經去傳入引起的感覺皮層 3b 區神經元出現功能重組變化觀察了 4 只恒河猴在腕部結扎正中神經和橈神經后 3b 皮層拇指-口面交接部神經元的可塑性變化.
正常恒河猴 S-09 的 3b 皮層拇指-口面交接部神經元雖然有交織但分界仍然明確, 僅記錄到 1 個拇指-口面部刺激激活的雙感受野單位\\(圖 5B 中紅-綠各半的圓圈\\). 結扎正中神經和橈神經 24 h 后, 除拇指端的刺激除尾內側保留少量的傳入外, 大部分拇指皮層位域呈現“靜區”: 不發生任何反應, 而口面部的刺激引起的皮層神經元反應仍然維持正常反應狀態\\(圖 5C\\).
在結扎神經3個月后, 同一只恒河猴根據原先標記的同一位置陣列電極記錄結果, 原先有少量反應的尾內側 3b 皮層仍然可以被來自拇指的觸覺刺激發生激活反應, 對拇指反應的神經元數量并未明顯增加; 但對口面部刺激反應的區域明顯擴大深入到拇指的皮層, 在進入拇指皮層1 mm處, 80%的單位都對下唇和下頜部的刺激發生激活反應; 在進入拇指皮層 2 mm 處, 有 40%左右的單位也對下唇和下頜部的刺激發生反應\\(圖 5D\\).
在神經結扎的其他 3 只恒河猴術后 3 個月\\(S-06和 S-17 為術后 90 天; S-11 為術后 95 天\\), 同樣可見來自拇指的傳入在 3b 皮層位域僅有極少數單位被來自拇指的觸覺刺激激活, 但來自口面部的區域明顯擴大至拇指的皮層, 在進入拇指皮層 1 mm 處, 約有30%~65%的神經元對下唇和下頜部的刺激發生反應;偶見對食指和中指刺激發生反應的單位; 但也有近1/2 區域是對任何部位刺激都不發生反應的靜區\\(圖 6\\).
3 討論
本研究觀察到, 在恒河猴感覺皮層 3b 區, 來自手部的傳入與來自口面部的傳入可以投射到位置相互毗鄰但分界明顯的腦區, 特別是拇指的“合谷”穴區和下唇及下頜的皮層位域的神經元相互接壤, 雖然有明確的分界, 但同樣出現相互滲透, 并存在一定比例的對拇指和下唇刺激發生共同激活的會聚神經元. 在采用結扎外周神經的方法使拇指失去傳入情況下, 來自口面部的傳入可以激活多數原本接受拇指傳入的 3b 皮層神經元, 表明拇指皮層位域發生了明顯的功能重組.
Lund 等人[12]在成年恒河猴大腦皮質同一腦區的毗鄰神經元記錄了這些腦細胞外周感受野的分布情況, 觀察到拇指與同側的口面部的傳入信息可以重合在同一皮質相互比鄰的神經元上, 也就是說, 雖然這兩個部位在軀體存在明顯的位置差異, 但其中樞神經系統的投射區卻在同一部位. Suzuki 等人[13]采用磁刺激法研究對腦活動影像的影響, 觀察到人的面部與拇指刺激傳入在大腦體感-Ⅰ區的位置是比鄰與重疊的. Yokochi 等人[14]在日本猴\\(Macaca fuscata\\)皮質的頂下小葉前部\\(7b 區\\)記錄到了具有特殊聯合外周感受野的神經元, 最為典型的是感受野分別位于面部和手部, 他們將其命名為“面-手神經元”. 1/2 的這類神經元具有顯著口面-手協調運動的功能, 特別是進食行為. 用 500 ms 電脈沖經微電極刺激嬰猴\\(Macaca sylvana\\)后頂葉皮質的特定分隔區域可引起從手運動到口和開口的反應[15]. Manger 等人[16]采用熒光雙標法同樣在猴的實驗中分析了手與面部的交互聯系, 他們觀察到由下頜神經支配的口鼻部\\(muzzle\\)與由 C2~3神經支配的下頜和頸部間缺乏交互聯系, 而皮質手部區\\(也由頸神經支配\\)與下頜和頸部存在明確的交互聯系. 他們認為, 手部與下頜的這種交疊是手部的外周傳入喪失后下頜和頸部傳入發生替代的神經聯絡基礎.
運動皮質也會發生功能重組. 同樣, Kaas 實驗室[17]在恒河猴出生 3~12 天切除頸髓 C3~5背柱失去感覺傳入后, 使其存活長大至3~5歲時觀察運動皮質的可塑性變化. 他們在恒河猴運動皮質的手指位域外側200 mm通過微電極的電流\\(10 mA\\)刺激可引起拇指屈曲和下唇與肩的聯合運動, 表明因感覺傳入受阻導致運動皮質手指位域變化和重組, 出現手指與面部運動的交替或同時出現.
Halligan 等人[18]1993 年發表了題為“Thumb incheek?\\(拇指在面頰?\\)”的研究報告. 1 例患有腕管綜合征的患者在截肢后出現幻肢覺, 面頰部的刺激引起的感覺卻出現在拇指部位. 手臂截肢后 24 h 內軀體感覺皮質可發生急性可塑性變化, 刺激同側面部可出現定位精確、形式特異、區分明確的幻肢覺[19]. 這么短時間出現體覺皮質可塑性改變無法用新軸突末梢芽生來解釋, 很可能是正常休眠的傳入轉為活動狀態\\(unmasking\\). Aglioti等人[20]跟蹤隨訪了一名左食指截肢患者的幻肢覺變化. 術后刺激左手殘存指及左臉能引出定位明確的幻肢覺, 這種幻肢覺在截肢 5個月后仍保持不變. 引起幻肢覺的性質與刺激的性質相同, 針刺樣痛刺激引起幻肢痛, 冷刺激引起幻肢冷覺. 截肢 3 年多以后, 幻肢覺在刺激同側殘存指同樣保持不變. 而同側面部的刺激卻難以引出幻肢覺,但對側面部有時卻有這種效應. 作者認為, 殘存指保持不變的原因在于手指功能協調和穩定性的需要,而面部的功能失代償是由于日?；顒有袨槿狈ο嚓P性所致. 而 Rijntjes 等人[21]采用非侵入性的經顱磁刺激和正電子發射技術研究了面神經麻痹患者的皮質功能重組, 發現拇短展肌\\(合谷穴區的主要肌肉\\)的誘發電位和區域腦血流均從該區向面神經麻痹區擴大,擴展到了面部肌肉的皮質代表區.
Pons 等人[22]在研究恒河猴大腦皮質去感覺傳入后功能重組的實驗中觀察到下頜部與拇指在感覺皮質的定位域是相互重疊的. 上肢幻肢痛患者的口唇部感覺域和面部顴肌運動域都在定向地朝失去神經傳入手區的感覺運動定位域靠攏[23]. Montoya 等人[24]采用感覺誘發電位神經電圖結合核磁共振腦影像技術在外傷性截肢患者研究了腦功能重組. 首先利用健側感覺皮質定位加權處理勾畫出患側拇指、小指和足拇趾的空間位置, 再研究截肢后下唇感覺皮質定位域及位移狀況, 探討幻肢痛引起的感覺皮質功能重組. 結果觀察到, 正常下唇的皮質定位可向拇指的感覺皮質移位達 2.4 cm 左右, 出現了較大范圍的可塑性變化; 但先天性上肢缺損的受試者則兩側下唇皮質位域則完全對稱.
在長期失去傳入聯系的情況下, 猴軀體感覺皮質 3b 區的手部定位域逐漸對同側面部觸覺刺激發生反應, 這種喪失的手皮質功能被來自面部傳入的重激活可能取決于手-面接壤緣的軸突出現的交互聯系.
用微電極在體覺皮質定位域記錄到對手或面部刺激反應的神經元后注射神經示蹤劑, 逆向標記的細胞分別分布在各自的定位域內, 手-面接壤緣有清楚的少髓磷脂的隔膜相限. 在丘腦、手部和面部標記的感覺神經元分別限制在腹后外側核\\(手部\\)和腹后內側核\\(面部\\)內, 因而面部刺激重新激活手皮質并不取決于原有的皮質內手-面接壤緣交互聯系網[25].
采用血氧水平依賴的功能性磁共振成像\\(bloodoxygen level dependent-functional magnetic resonanceimaging, BOLD-fMRI\\)技術觀察到在頸部切斷背柱的恒河猴, 來自手部的刺激引起的 BOLD 反應區域明顯縮小, 下頦部輕觸刺激引起的反應基本位置不變;但下頦部強掐捏刺激引起的 BOLD 反應則占據了原先手區的大部分位置, 出現了明顯的功能重組. 電生理實驗得出了同樣的結果[26]. Clarke 等人[27]在 1 位右側三叉神經節上頜支和下頜支切除的患者術后 7 天觀察到, 刺激其右手或右前額, 患者能體驗到一種來自去神經支配區域的移位性感覺\\(發生率為 6%~19%\\).刺激右手拇指, 其感覺出現在右側面部; 刺激右側前額和右中、環指時, 其感覺出現在面頰部, 且定位更為精確.
Farne 等人[28]做了一項更為有趣的調查, 他們分析了截肢者手皮質對面部皮膚刺激發生反應的功能重組, 還觀察到手同種異體移植后皮質的感覺運動區功能 5 個月后逐漸恢復. 但在移植術后的一段時間內, 新近喚醒手皮質的感知在同時觸刺激同側面部時明顯受阻, 也即同側面部的感知壓抑了移植手的感知. 移植過程中的這種面-手可塑性變化的消退在術后 5 個月才恢復, 6 個月時完全恢復正常. 皮質功能的固有竟爭性和優勢原則在這種截肢與移植過程中觀察到的現象是最好的例證.
皮層功能重組機制并不十分明了, 可能與神經元的軸突側枝發芽、樹突伸展和新突觸形成等因素有關[29~31]. Flor 等人[32]評述了過去 10 余年外周和中樞神經系統在生理和病理生理學過程中的微形態、機能和分子水平的可塑性改變與幻肢痛\\(覺\\)之間的關系,認為外周和中樞的敏化、特別是皮層的病理狀態下的功能重組與幻肢現象密切相關, 也可能涉及“面口合谷收”的病理過程的機制.
由此看來, 在生理狀況下合谷穴區與面口部的軀體感覺傳入大腦神經元的毗鄰、會聚及整合是“面口合谷收”的生理學基礎. 而病理狀況下\\(面部或者手的去感覺傳入、去運動傳出\\), 大腦皮層和丘腦的手區和面區之間的功能重組是“面口合谷收”重要的生物學機制. 換言之, 合谷穴區與口面部從外周的距離來看似乎不是局部的關系, 但在大腦皮層是接壤、會聚而居, 并存在交互支配\\(cross-innervation\\)、功能互換\\(cross-function\\)和交互激活\\(cross-activation\\).
“面口合谷收”是對針灸臨床診療規律認識的升華, 該穴位的聯系部位反映了針灸文獻研究中揭示的經脈系統是溝通人體體表-體表上下之間, 體表與臟腑內外之間的聯絡、整合、反應系統. 探討這種診療規律的醫學原理, 可以從總體上闡明針灸的作用機制和穴位主治規律的實質, 從而對針灸的現代化和針灸臨床療效的提高產生積極的作用. 當然, 穴位效應的發揮不是僅依靠與腦存在“毗鄰”關系的聯通.
對合谷穴與口面部的相互聯系及聯系途徑的深入研究, 不但可以證實古代醫學家所創立的經脈學說有豐富的臨床診療規律作為科學依據, 同時也為人們更科學地認識腦功能、揭示神經信息的傳導規律及腦的聯絡、整合原理提供新的、有價值的研究思路.
