低氧預適應是指一般通過預先給予機體一個溫和的\\( 亞致死性\\) 缺血/低氧刺激，可以增強機體對隨后更嚴重的\\( 致死性\\) 缺血/低氧刺激的耐受力的現象。Lü 等［1］在上世紀六十年代發現小鼠經急性重復低氧暴露，可以使小鼠的低氧耐受時間增加。

利用急性重復低氧模型發現小鼠低氧耐受的極限約為 6% 氧氣濃度，而低氧預適應小鼠的體溫則降低到 25℃左右［2］。Lü 等提出有組織細胞機制參與低氧預適應的形成，能量代謝的變化則可能是低氧預適應形成的一個關鍵點［3］。通過基因表達調控等使組織細胞從正常代謝狀態轉變為低代謝狀態，這種變化機制可能是在極端條件下細胞面臨生死抉擇時的基因表達的變化。

蛋白磷酸酶\\( protein phosphatase，pp\\) 1 是腦內含量第二豐富的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，pp1 是真核細胞中高度保守的調節細胞能量使用的酶［4，5］。哺乳動物細胞中有三種 pp1 基因，它們分別編碼pp1α，pp1γ，和 pp1β / σ。其中 pp1γ 表達變化可能是調節細胞能量變化的最初的關鍵變化［5］。海馬組織是大腦對低氧/缺血最為敏感的部位，本研究利用急性重復低氧小鼠模型，研究成年小鼠海馬組織中pp1γ 的變化，并探討其與低氧耐受形成的關系。

材料和方法

1 材料

18 ～ 22 g 雄性昆明小鼠\\( 6 ～ 8 周\\) 購于內蒙古大學實驗動物中心。Trizol，superscript III 購自 In-vitrogen 公司; Qiagen DNA extraction kit 購自 Qiagen公司; EZ DNA Methylation kit 購自 ZYMO Ｒesearch公司; 2X Ｒeal-time PCＲ Mix 購自 Bioner 公司; 兔源PP1γ 多克隆抗體購自 Santa Cruze 公司; 鼠源 β-actin單克隆抗體購自 Sigma 公司; 辣根過氧化物酶標記的羊抗兔的二抗和驢抗鼠的二抗購自北京博奧森生物技術有限公司; BCA 試劑購自 Pierce 公司; pp1 活力試劑盒為 Genmed Scientifics 國產試劑。

2 方法

2． 1 低氧預適應小鼠模型的復制 雄性小鼠隨機分為 H0、H1 和 H4 組，按我中心傳統方法復制模型［6-9］，即 H0 組不進行低氧暴露\\( 空白對照組\\) ，H1組低氧暴露 1 次\\( 實驗對照組\\) ，H4 組低氧暴露 4 次\\( 低氧預適應組\\) 。低氧結束斷頭取腦，剝離海馬。

2． 2 定量 PCＲ \\( Ｒeal-time PCＲ\\) 用 Trizol 提取細胞總 ＲNA，紫外分光光度計檢測 ＲNA 純度和含量。按照逆轉錄反應試劑盒進行反轉錄 PCＲ，得到 20 μlcDNA 產物 － 20℃ 保存。使用 ABI 公司的 96 孔板，每孔依次加入 cDNA 1 μl，2 ×12． 5 μl，3’和 5’端引物各 1 μl，引物序列如下，無菌水 9． 5 μl，在 ABI7900 Ｒeal-time PCＲ 反應儀上反應，每個樣本設 3 個復空。反應參數: 94℃預變性3 min，再進行92℃，30s; 54． 5℃ ，35 s; 72℃ ，30 s\\( 40 cycles\\) ，最后 72℃ 延伸 5 min 停止反應。

PP1γ F: GAGAACGAGATCCGAGGACTC， Ｒ:CGTATTCAAACAGACGGAGCAA; β-actin F: GGCT-GTATTCCCCTCCATCG， Ｒ: CCAGTTGGTAACAAT-GCCATGT。

2． 3 蛋白免疫印跡\\( Western Blot\\) 檢測蛋白表達使用碧云天公司的 ＲIAP buffer 裂解海馬組織，用 BCA 試劑測定蛋白含量，加上樣緩沖液調到各組蛋白量一致，10% SDS-PAGE，壓縮膠20 mA，分離膠 30 mA，電泳結束后 400 mA 轉移至 PVDF 膜，預染蛋白 marker 確定蛋白分子量標準位置。用含10% 脫脂奶粉 TTBS 液封閉，TTBS 洗 3 次，每次 10min; 加入 PP1γ \\( 1 ∶ 500 \\) 或 β-actin \\( 1 ∶ 1000 \\) 一抗，4℃ 孵育過夜，TTBS 洗 3 次，每次 10 min; 1∶ 10000 加入辣根過氧化物酶標記相應的二抗，37℃ 孵育 1 h，TTBS 洗 3 次，每次 10 min; 按 Pierce 公司的 ECL 試劑盒進行熒光顯色反應。暗室中曝光，顯影，定影。用分析軟件 bandscan 分析每個條帶的灰度值。

2． 4 pp1 磷酸酶活性活力實驗 按照國產試劑公司 Genmed Scientifics 生產的 pp1 活力檢測試劑盒提供的方法提取蛋白并檢測各組小鼠海馬組織 pp1 磷酸酶活性活力。

2． 5 pp1γ 啟動子區\\( 95 bp ～ 321 bp\\) DNA 甲基化測序\\( Bisulfite-modified DNA sequencing，BMDS\\) 利用 Qiagen DNA extraction kit 從小鼠海馬組織提取基因組 DNA，按照 EZ DNA Methylation kit 將基因組DNA 進行轉換，轉換后的 DNA 進行巢式 PCＲ 擴增，外部引物為 5’-AGGGGTGATTTAGTGTTGAA-3’和5’-TCTCACTCGTCCTCCTTCCTCA-3’; 內部引物為5’-GTTAGATTTTTGTTTTTAAGTAGTAGAGT-3’，和 5’-CTTCCTCCTCCTCTCGCCACT-3’。PCＲ 產物純化后連接入 PCＲ2． 1 載體中，轉化 E． Coli 后挑取 10 個陽性克隆送公司測序。

統計學處理: 結果以 x珋 ± s 表示，用 SPSS10． 0 數據統計軟件 ANOVA 和 Tukey 對組間數據進行處理和分析，P ＜0． 05 為差異有統計學意義。

結 果

1 低氧預適應小鼠海馬組織 pp1γ mＲNA 表達的變化

pp1γ mＲNA 相對豐度以 delta-delta CT 表示，其中以 β-actin 為內參\\( Fig． 1\\) 。pp1γ1 mＲNA 相對豐度在 H0 組為 0． 049 ± 0． 013，H1 組為 0． 040 ±0． 008，H4 組為 0． 028 ± 0． 007，H4 組與 H0 組相比，差異有統計學意義\\( P ＜0． 01，Fig． 1\\) 。

2 低氧預適應小鼠海馬組織 pp1γ 蛋白表達的變化

pp1γ 蛋白豐度通過 Western Blot 來檢測\\( Fig． 2A\\) ，其相對豐度以目的蛋白豐度/beta-actin 蛋白豐度表示。pp1γ 蛋白相對豐度在 H0 組為 1． 41 ±0． 18，H1組為 1． 32 ±0． 19，H4 組為 1． 09 ±0． 11。H4 組 pp1γ蛋白水平降低，與 H0 組相比，差異有統計學意義\\( P＜ 0． 05，Fig． 2B\\) 。

3 低氧預適應小鼠海馬組織 pp1 磷酸酶活性的變化

pp1 磷酸酶活性實驗檢測 H0 組、H1 組和 H4 組海馬組織中 pp1 磷酸酶的活性，H0 組的活性為2． 15± 0． 61，H1 組的活性為 1． 16 ± 0． 15，H4 組的活性為1． 12 ± 0． 16，H1 組和 H4 組分別與 H0 組相比，差異有統計學意義\\( P ＜ 0． 05\\) ，說明急性重復低氧預適應使 pp1 磷酸酶的活性降低\\( Fig． 3\\) 。

4 低氧預適應小鼠海馬組織 pp1γ 啟動子區\\( 95 ～321 bp\\) 甲基化的改變

利用 Methyl Primer Express v1． 0 軟件對 pp1γ 啟動子區 416 bp 片段進行分析\\( 95 ～321 bp\\) ，發現該片段包含 49 個 CpG 點，該段 CpG 二核苷酸高于0． 6符合 CpG 島特征。利用 Bisulfite-Modified DNASequencing 研究發現 H0、H1 和 H4 三組 pp1γ 啟動子區\\( 95 ～321 bp\\) 甲基化情況未見顯著差異，而該段第12 位和38 位 CpG 都為半甲基化狀態\\( Fig． 4\\) 。

討 論

神經細胞的正常功能依賴于持續的氧和糖的供給以產生 ATP 去維持細胞內外的離子分布差異，低氧會因為 ATP 產生的不足而使神經細胞受到損傷［10］。因此，缺血/低氧環境下細胞存活的關鍵是避免 ATP 的快速下降，而神經細胞可以通過改變基因表達變化來改變其代謝策略使細胞在特殊環境下實現生存［8］。pp1γ 對于神經細胞能量代謝有重要作用［5］，pp1γ 轉錄起始點上游有一段 300 bp 的 GC 含量高達 79% 的區域，這段高 GC 區控制著 pp1 的轉錄［11］。我們先前研究顯示低氧預適應降低海馬腦區 DNMT3A 和 DNMT3B 的表達［12］。本研究主要討論 pp1γ 在低氧預適應過程中作用及其變化與其DNA 甲基化的關系。

Taylor 等［13］研究顯示低氧條件下 pp1γ 表達降低，與 Taylor 等研究結果相似，我們的研究結果顯示低氧預適應可以使 pp1γ 在 mＲNA 和蛋白水平表達均降低。同時我們研究顯示 pp1 的磷酸酶的活力降低，雖然我們沒有直接檢測 pp1γ 磷酸酶的活力的變化，但從 pp1 活力的變化，我們可以推測低氧預適應過程中 pp1γ 磷酸酶的活力可能降低。pp1γ 靶蛋白之一的環腺苷酸應答原件結合蛋白\\( CＲEB\\) 在神經細胞功能中有重要作用，CＲEB 的功能的變化是通過其絲氨酸\\( Ser-133\\) 磷酸化變化實現的［5］，而其絲氨酸的去磷酸化作用是由 pp1γ 調節的，一些與代謝相關基因，如 Bcl-2 等通過 CＲEB 參與到低氧或氧化抑制條件下的神經保護［14，15］。利用我們的急性低氧預適應小鼠模型發現小鼠海馬 CＲEB 的磷酸化水平升高［16］，因此 pp1γ 的變化可能是預適應早期項\\( early phase\\) 形成的關鍵事件。

DNA 甲基化是真核細胞基因表達調控的一種重要的方式，DNA 甲基化在神經系統中有重要作用，其在神經發育和分化，突觸可塑性，學習記憶以及維持神經元的生存等相關基因的表達方面具有重要作用［17］，催化 DNA 甲基化的酶為 DNA\\( 胞嘧啶-C5\\) 甲基轉移酶［18］。我們先前研究報道低氧預適應過程中，DNA 甲基轉移酶 3A 和 3B 表達降低［12］，同時 pp1γ 啟動子區符合 CpG 島特征［11］，因此我們對pp1γ 啟動子區\\( 95 bp ～ 321 bp\\) 進行了 BMDS 研究。

結果

顯示低氧預適應沒有改變其甲基化狀態，因此我們推測急性重復低氧在短時間內\\( 幾個小時\\) 沒有影響其啟動子區\\( 95 bp ～321 bp\\) 甲基化狀態，其表達變化可能是由其它因素引起的。通過急性重復低氧小鼠模型觀察到低氧預適應可以使腦保護基因表達上調并使腦損傷基因表達下調，上調的基因一般為低代謝/抑制凋亡的基因［8］。在能量代謝調節中有重要作用的 pp1γ 表達的下調，正是通過低代謝來實現神經保護的。雖然 DNA 甲基化在基因表達調控中有重要作用，但本研究觀察到 pp1γ 表達變化不依賴于其動子區\\( 95 bp ～ 321bp\\) 甲基化狀態的改變，其表達變化的原因有待于進一步研究。

參 考 文 獻

［1］Lu GW． Tissue-cell adaptation to hypoxia ［J］． Adv Pathophysiol，1963，1: 197 － 239．

［2］Cheng F，Xie S，Guo M，et al． Altered glucose metabolism andpreserved energy charge and neuronal structures in the brain ofmouse intermittently exposed to hypoxia ［J］． J Chem Neuroanat，2011，42: 65 － 71．

［3］Lu GW，Yu S，Li ＲH，et al． Hypoxic preconditioning: a novel in-trinsic cytoprotective strategy ［J］． Mol Neurobiol，2005，31: 255－ 271．