AIM2是近些年來新發現的一種模式識別受體\\(pattern recognition receptors,PRR\\),能夠感受DNA病毒或細菌感染時釋放到細胞漿的dsD-NA[1],通過其C末端HIN-200區識別dsDNA后,其N末端的pyrin區與ASC的N末端的pyrin區結合,而ASC的C末端的CARD與Caspase1前體的CARD區結合,募集Caspase1前體,形成dsDNA-AIM2-ASC-Caspase1炎性復合體,即AIM2炎癥小體,活化的Caspase1片段進而引起pyroptosis形式的細胞死亡,或裂解胞質內IL-1β前體和IL-18前體,促進IL-1β和IL-18的成熟和釋放,從而誘發炎癥反應[2]。AIM2也是唯一定位于細胞質的dsDNA感應蛋白[3]。放射治療過程中,當細胞吸收一定的輻射能量后,射線都可能直接與細胞內的結構發生作用,直接或間接地損傷細胞DNA,導致細胞死亡。直接損傷主要由射線直接作用于DNA,引起DNA分子出現斷裂、交聯。
間接損傷主要由射線對人體組織間液發生電離,產生自由基,這些自由基再和生物大分子發生作用,形成不可逆損傷,導致細胞死亡。胸部腫瘤放射治療過程中,由射線誘發的這些斷裂的DNA片斷是否也能被炎細胞中的AIM2識別并活化Caspase1,促進IL-1β和IL-18的成熟和釋放,從而誘發放射性炎癥反應呢?為了回答此問題,我們做了下述探索。
1材料與方法
1.1細胞株THP1細胞\\(人白血病單核細胞\\),來自武漢大學人民醫院中心實驗室。
1.2主要試劑引物由蘇州金唯智公司合成,序列見表1;β-actin,AIM2抗體以及二抗,來自武漢三鷹生物技術有限公司;檢測IL-1β的ELISA試劑盒,購自達科為生物技術有限公司;Caspase1活性檢測試劑盒,購自碧云天生物技術研究所。
1.3細胞培養THP1細胞培養于RPMI1640培養基中,含10%胎牛血清和青霉素和鏈霉素,置于37℃、5%CO2培養箱,懸浮生長至一定濃度之后,接種于六孔板。
1.4細胞照射將THP1懸浮細胞充分混勻,盡量吹打成單個細胞的懸液,按照5×105/孔接種于6孔板,在Varian直線加速器下操作。選擇SSD=1m,用6-MVX-線照射,劑量率600unit/min,各孔給予不同的照射劑量,劑量選擇參照文獻[4-5]。放入培養箱48h后做后續處理。
1.5RT-PCR總RNA的提取按照TRIzol試劑盒說明書進行。采用Fermentas公司的RevertAidFirstStrandcDNASysthesisKit做逆轉錄合成cD-NA。然后以cDNA為模板配置PCR反應體系,含2×PCRMasterMix,引物和水。
PCR反應條件為:94℃5min預變性,94℃變性30s,60℃退火30s,70℃延伸1min,Actin循環次數為20次,AIM2循環次數為25次。最后72℃延伸10min,4℃保存PCR產物。反應結束后,經1.1%的瓊脂糖凝膠電泳,在BioRad凝膠成像系統下檢測并分析PCR結果。
1.6westernblot取出6孔板,吸取各孔細胞到EP管,1800r/min離心5min后棄去培養基,用PBS洗一次,加入150μl/孔的RIPA裂解液\\(含1∶100PMSF和1∶100cocktail\\),冰浴30min之后,12000r/min離心15min,收集裂解液。吸取上清蛋白質備用。經BCA蛋白定量之后,按照1∶9比例與蛋白上樣緩沖液混勻,經90~100℃處理5~10min讓蛋白質變性。制作SDS-PAGE膠,下層為10%的分離膠,上層為5%的濃縮膠。
按照每孔蛋白總量一致的方式點樣。電泳至溴酚藍接近膠底。割掉多余的膠,轉到PVDF膜,恒定電流200mA轉膜1.5h。經TBST洗滌3次后,用脫脂牛奶封閉1h。一抗AIM2用TBST按照1∶1000稀釋,actin按照1∶3000稀釋,浸泡膜條,4℃過夜。二抗用稀釋液按照1∶4000稀釋,搖床孵育1h。然后洗膜,經ECL液暗室曝光,顯影。
1.7ELISA吸取各孔培養基200μl/孔,1800r/min離心5min后,取上清。根據實驗孔\\(空白和標準品\\)數量,確定所需的板條數目。加樣:稀釋后的細胞因子標準品按100μl/well加至標準品孔,樣品按100μl/well加至樣品孔,以dilutionbufferR\\(1×\\)為空白對照孔。加檢測抗體:按50μl/well加入稀釋的biotinylatedantibody?；靹蚝笊w上封板膜,室溫\\(18~25℃\\)孵育3h。洗板:去凈孔內液體,加入1×washingbuffer,靜置1min后棄去孔內液體。重復3次,每一次在濾紙上拍干。加酶標記物:按100μl/well加入Streptavidin-HRP。
貼上封板膜,室溫\\(18~25℃\\)孵育20min。洗板:重復上述步驟。顯色:按100μl/well加入TMB,室溫\\(18~25℃\\)避光孵育5~30min,根據孔內顏色的深淺來判定終止反應。通常顯色10~20min可以達到很好的效果。終止反應:按100μl/well迅速加入stopsolution,終止反應。
讀板:終止后10min內,用檢測波長450nm讀值。
1.8Caspase1活性檢測吸取細胞到對應的EP管,1800r/min4℃離心5min收集細胞,棄上清,PBS洗滌一次。按照每200萬細胞加入100μl裂解液的比例加入裂解液,重懸沉淀,冰浴裂解15min。4℃16000~20000g離心10~15min。
收集上清到冰浴預冷的離心管中。按照試劑盒說明稀釋pNA為6個不同濃度后繪制各孔A405標準曲線,每10μl待測樣品加入10μl特異性底物Ac-YVAD-pNA\\(2mmol/L\\),加80μl檢測緩沖液至總體積為100μl?？瞻讓φ湛诪?0μl檢測緩沖液加10μlAc-YVAD-pNA\\(2mmol/L\\)。37℃孵育4~6h,等到有明顯的顏色變化時,用酶標儀檢測各孔A405值。樣品A405值減去空白對照A405值即為樣品中Caspase1催化產生pNA的吸光度。通過標準曲線對比即可計算出樣品中催化產生pNA的量,從而計算Caspase1的催化活性。
1.9統計分析采用SPSS19.0軟件進行統計分析,采用student’st檢驗,P<0.05則有顯著性差異。
2 結果
2.1X線照射使AIM2在mRNA水平上調THP1細胞經過6-MVX線分別照射2、4、6和10Gy,48h后經RT-PCR檢測發現AIM2在mRNA水平上調\\(圖1\\)。經ImageJ軟件做灰度分析,與對照組相比,P<0.05\\(表2\\)。
2.2X線照射使AIM2在蛋白質水平上調THP1細胞經過6-MVX線分別照射2、4、6和10Gy,48h后經westernblot檢測發現,隨著照射劑量的增加,AIM2的蛋白質水平逐漸上調\\(圖2\\)。經ImageJ軟件做灰度分析,與對照組相比,P<0.05\\(表3\\)。
2.3X線照射使Caspase1催化活性增加THP1細胞經過6-MVX線分別照射2、4、6和10Gy,48h后檢測Caspase1催化活性。結果發現隨著照射劑量增加,Caspase1催化活性也增加\\(圖3\\)。與對照組相比,P<0.05。
2.4X線照射使IL-1β分泌增加THP1細胞經過6-MVX線分別照射2、4、6和10Gy,48h后用ELISA檢測各孔培養基上清中IL-1β的濃度,發現隨著照射劑量的加大,IL-1β的水平逐漸升高\\(圖4\\)。與對照組相比,P<0.05。
3 討論
放射性肺損傷是胸部腫瘤放療后的常見并發癥,主要表現為早期的放射性肺炎和晚期的放射性肺纖維化,與肺的受照體積和受照劑量密切相關,與多種細胞因子的表達及信號轉導也密切有關[6]。
目前尚未完全闡明放射性肺炎的發生機制。一般認為,放射性肺炎是多因素參與、多細胞因子級聯效應的結果,與靶細胞損傷和活性氧自由基有關,與細胞因子的產生、表達和信號轉導有關[7]。最近有報道稱,放射性肺炎實質上是由放射直接損傷及放射誘導自身免疫反應等引起的一種炎細胞性肺泡炎性反應,其發生高峰期為放射治療后2~3個月,一般不可逆[8]。因此,本實驗選擇THP1細胞來模擬體內單核細胞受高能X線照射后,誘發放射性肺炎,從而探索其發生機制。
炎癥小體\\(inflammasome\\)是細胞內由Caspase1、ASC、NLR、AIM2等組成的多聚體蛋白復合物,可調節IL-1β和IL-18的成熟與釋放,通過誘導Caspase1活化和細胞程序性死亡對外源性或內源性危險信號產生應答[9]。AIM2炎癥小體是由AIM2/ASC/Caspase1/IL-1β/IL-18組成的復合物。
AIM2\\(absentinmelanoma2\\)是一種細胞質內蛋白質,能夠感知胞質dsDNA而激活Caspase1,促進IL-1β和IL-18等一些炎癥因子的釋放,從而誘發炎癥反應[10]。AIM2的N末端含有熱蛋白\\(pyrin\\)結構域\\(PYD\\),其C末端為核苷酸/寡糖結合結構域。當AIM2與細胞質雙鏈DNA結合后,它通過PYD相互作用而招募另一個細胞質蛋白質ASC,并誘導了炎性體的組裝,從而引起隨后Caspase1的激活和IL-1β的產生,誘導天然免疫反應甚至Pyroptosis樣細胞死亡[11]。本研究發現,經過單次小劑量照射后,AIM2在蛋白質水平有所上調,說明放射線照射有助于AIM2蛋白質表達量的增加。
Caspase1是炎性體的效應蛋白,參與了炎性體的形成并在其中被激活。當細胞受到各種胞外病原體或胞內危險信號刺激時,細胞內會裝配形成炎性體,并招募無活性的pro-Caspase1,形成pro-Caspase1的相對高濃度,此時酶原發生水解形成四聚體,最終成為具有活性的Caspase1。
Caspase1負責將無活性IL-1β前體剪切為成熟的IL-1β[12]。
本研究發現,經過2、4、6和10Gy的高能X線照射后,THP1細胞中Caspase1的催化活性逐漸增強,這也說明放療有助于提高AIM2炎癥小體中Caspase1的催化活性。
白細胞介素是由活化的單核-巨噬細胞及淋巴細胞等產生的一類細胞因子,它作用于淋巴細胞、巨噬細胞或其他細胞,負責信號傳遞,調節T淋巴細胞和B淋巴細胞的活化、增殖與分化,并在抗病毒免疫反應中發揮重要作用[13]。
IL-1β作為一種維系慢性炎癥的重要生物因子,在維系局部炎癥微環境中能夠引起組織損傷的同時促進腫瘤的發生、發展。近年來,IL-1β與各種病理狀態及腫瘤之間密切聯系的證據也越來越多。研究顯示,慢性肝炎、肝癌患者血清中IL-1β表達明顯升高。
IL-1β與肺癌等腫瘤形成有關,能提升腫瘤免疫逃逸潛能[14]。本研究結果顯示,經過單次小劑量的高能X線照射后,Caspase1的催化活性增加,從而顯著促進THP1細胞分泌更多的IL-1β,從而誘發放射性肺炎。
總之,本研究采用THP1細胞在體外模擬單核細胞放療過程中誘發放射性肺炎的過程,用不同方法探測照射后THP1細胞中AIM2炎癥小體通路,包括AIM2的轉錄水平和蛋白質水平,Caspase1催化活性,和上清液中IL-1β水平的變化,最終發現不同劑量的X線照射能夠活化THP1細胞中的AIM2炎癥小體的各組成成分,可能作為解釋放射性肺炎發生的機制之一。
