功能性慢性內臟痛是一組以腹痛或腹部不適同時伴有排便習慣及大便性狀改變為主要特征的腸道功能性疾病，內臟高敏是其重要的病理生理學基礎，但目前其分子生物學機制尚不清楚。長期以來，傳統的觀點認為疼痛在脊髓水平的調制和整合只與神經元有關，神經膠質細胞僅對神經元起支持和營養作用。然而，最近的文獻報道，慢性疼痛時神經膠質細胞激活并且對疼痛的整合和傳導起重要的作用。研究表明，脊髓小膠質細胞在功能性慢性內臟痛的啟動發揮重要作用，而對內臟痛的維持作用尚未研究。本研究通過對新生期大鼠給予結直腸擴張觀察脊髓小膠質細胞是否參與大鼠幼年、青年到成年內臟高敏的維持過程。
方 法
1. 實驗動物及動物分組新生第 8 天雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠，由徐州醫學院實驗動物中心提供。新生大鼠與母鼠同籠直到 28 天，鼠乳喂養。母嬰分離后，每 4 只子鼠一籠，保持室溫（23±1）℃及 12 h/12 h 明 /暗光照，能夠自由取食和進水。隨后大鼠正常飼養到第 6（幼年）、8（青年）、12（成年）周進行下述各項實驗。采用隨機數字表法，將大鼠隨機分為2 組（n = 15）：假手術組（S 組）、新生期結直腸擴張組（CRD 組）。
2. 試劑和儀器羊抗大鼠 Iba-1（Abcam 公司，美國），Alexa594 驢抗羊 IgG \\(Life Technologies 公司，美國 \\)，BL-420E + 生物機能實驗系統（成都泰盟科技有限公司，中國），熒光顯微鏡（Olympus IX-81，日本）。
3. 功能性慢性內臟痛模型建立參照文獻通過新生期反復結直腸擴張（colore-ctal distension, CRD）的方法制備功能性慢性內臟痛模型：新生大鼠于出生后第 8、10、12 天，每天上午固定時間給予兩次結直腸擴張，兩次時間間隔30 min。結直腸擴張是將直徑 3 mm，長 20 mm 的血管成形術導管從肛門插入至清醒新生大鼠的降結腸，用 0.3 ml 水擴張產生 60 mm Hg 的壓力在結腸內留置一分鐘后，將其減壓退出。S 組大鼠除未進行結直腸擴張外，其他操作均與 CRD 組一致。
4. 行為學檢測（1）腹壁撤退反射（abdominal withdrawal re?ex,AWR）評分及痛閾：兩組大鼠在出生后第 6、8、12 周進行行為學檢測。按 Lin, C等報道的方法，大鼠在實驗前 18 h 禁食不禁水，用乙醚或氟烷麻醉后，將未充氣的球囊涂石蠟油后插入結直腸內，將大鼠放置在 20 cm×6 cm×8 cm 的有機玻璃箱內觀察，約 30 min 大鼠完全適應后開始實驗。分別采用20、40、60、80 mmHg 四個壓力，每次擴張持續20 s，刺激間隔 4 min，取 3 次評分之均值。為了能客觀比較 S 組和 CRD 組大鼠的各項指標，檢測時采用單盲法，即對實驗操作者隱瞞實驗動物的類型。
AWR 的評分標準為：0 分：無明顯行為變化；1 分：大鼠身體不動或僅有簡單的頭部運動；2 分：腹部肌肉開始收縮；3 分：下腹壁抬離箱底或明顯收縮變平；4 分：腹壁拱起或伴身體、骨盆躬起。
AWR 方法測定痛反應閾：球囊放置等過程同前，通過注射器持續、緩慢加壓，每 10 mmHg 為一壓力梯度，每個壓力停留 10 s，間隔 4 min，以肉眼觀察出現明顯的下腹壁抬離箱底或明顯收縮變平（AWR=3 分）時的最小壓力值為痛閾。擴張壓力范圍在 10 mmHg ～ 80 mmHg 之間；每只大鼠重復三次，取平均值。
（2）腹外斜肌放電的測量前述方法置入球囊后，將大鼠固定于手術臺上，用 1% 左右的氟烷維持麻醉，并隨時通過測量疼痛反應調整氣體麻醉機內氟烷的流量，使大鼠不發生自主活動，卻有疼痛反應存在。將銀絲雙極電極插入腹股溝韌帶上方、距中線 1.5 cm 的一側腹外斜肌上，待適應 15 min 后，對清醒大鼠予以結直腸擴張，壓力梯度分別為 20、40、60、80 mmHg，每次加壓 10 s，刺激間隔 4 min。用 BL-420E + 生物機能實驗系統記錄在不同壓力的結直腸擴張刺激下大鼠腹外斜肌的放電活動變化。記錄參數設置：
高頻濾過 2 KHz，時間常數 0.001 s，采樣頻率為40 Hz，靈敏度 500 ?v，掃描速度 250 ms/div。實驗環境要求安靜，保持相對濕度在 40％～ 70％，室溫 23℃～ 27℃范圍之內。
5. HE 染色及免疫熒光
兩組大鼠于出生后第 6、8、12 周行為學測定結束后 , 每組隨機取 4 只在 10% 水合氯醛腹腔注射麻醉下，迅速開胸暴露心臟經升主動脈插管，依次灌注 4℃生理鹽水 200 ml 及 4％多聚甲醛 300 ml，取距肛門 10 cm 處腸段置于 4％多聚甲醛后固定6 h，移至 30％蔗糖脫水至組織沉底，常規石臘切片，HE 染色，光鏡觀察腸粘膜形態，切片由徐州醫學院病理科專家診斷，觀察指標為結直腸局部組織有無損傷和炎癥等異常改變。
同時取脊髓 L2～ S4節段后固定，沉糖。用恒冷冰凍切片機切片（厚度 30 ?m），于 L2～ S4脊髓節段每隔 4 片取 1 片，PBS 漂洗 5 min×3 次，用含有 0.3% Triton X-100 的 10% 驢血清室溫封閉2 h，加入羊抗大鼠 Iba-1 抗體（1：200），4℃孵育 24 h，PBS 漂洗 5 min×3 次，暗室內加入 Alexa594 驢抗羊 IgG（1：200），室溫孵育 2 h，PBS 漂洗 5 min×3 次，將切片貼于載玻片上，自然晾干后，90% 甘油封片，立即用熒光顯微鏡觀察及拍片。
每個標本隨機取 L2～ S4脊髓節段的 5 張切片，依Rexed 分層法將脊髓灰質分成 10 層，以大鼠脊髓背角Ⅰ - Ⅱ板層來計數活化的小膠質細胞，并計算小膠質細胞活化率（活化的小膠質細胞數 ÷ 小膠質細胞總數×100%）。靜息狀態小膠質細胞胞體較小，突起細長，熒光強度較弱；活化的小膠質細胞胞體增大，突起縮短增粗，熒光強度變深。
6．統計學方法
數據用均數 ± 標準差 \\(x±SD\\) 表示，采用SPSS 13.0 統計學軟件進行數據分析，兩組間比較采用成組t 檢驗，P < 0.05 表示差異有統計學意義。
結 果
1．HE 染色觀察結直腸病理變化情況常規病理切片光鏡下：兩組大鼠不同時期結直腸組織結構完整，排列整齊，黏膜表面光滑，固有層內腸腺規則；胞質呈嗜酸性紅染，胞核為圓形或橢圓形，染成均勻的藍黑色，形態規則，大小較為一致，核仁清晰可見；周圍間質無明顯水腫，未見中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞浸潤。
2．AWR 評分、痛閾及腹外斜肌放電的變化大鼠出生后第 6、8、12 周，與 S 組相比，CRD 組大鼠在 20、40、60、80 mmHg 結直腸壓力下 AWR 評分及腹外斜肌放電幅度明顯增加，痛閾明顯降低（P < 0.05，見表 1 ～ 3）。
3．免疫熒光檢測小膠質細胞的活化情況與 S 組比較，CRD 組大鼠在出生后第 6、8、12 周脊髓背角Ⅰ - Ⅱ板層小膠質活化數及活化率明顯增加（P < 0.05，見表 4 和圖 1）。
討 論
新生早期是傷害性感覺神經回路發育的關鍵時期，此時的疼痛刺激可以導致新生個體神經傳入通路永久性的改變。新生兒的神經系統以可塑性強為顯著特征。最近臨床觀察發現，功能性慢性內臟痛的病人與健康人相比，多有童年不良生活經歷。Lin C等報道，新生期結直腸擴張可以導致成年大鼠功能性慢性內臟痛。本研究結果顯示新生期給予結直腸擴張的大鼠與對照組相比，在出生后第 6、8、12 周 AWR評分及腹外斜肌放電幅度明顯增加，痛閾明顯降低，且局部沒有明顯的結直腸病理改變，表明功能性慢性內臟痛模型制備成功，且從幼年一直維持到成年。
神經元的敏化被認為是導致慢性疼痛的主要原因。然而最近的文獻報道：神經膠質細胞與痛信號的傳導和調控關系密切，神經膠質細胞可分泌一系列細胞因子和生長因子，改變神經元周圍的化學環境，影響神經元的興奮性。小膠質細胞是中樞神經系統的固有免疫細胞，起免疫監視、免疫防御及免疫調控的作用。研究已經證實，脊髓小膠質細胞與外周損傷導致的慢性疼痛的產生密切相關。以往研究表明，小膠質細胞活化參與慢性疼痛的啟動，星形膠質細胞激活與慢性疼痛的維持密切相關。
在功能性慢性內臟痛中小膠質細胞發揮啟動作用已被證實，本實驗結果發現，大鼠出生后第 6、8、12 周，CRD 組脊髓小膠質細胞活化數及活化率與對照組比較明顯增高，表明小膠質細胞活化參與功能性慢性內臟痛維持階段，提示功能性慢性內臟痛與外周損傷導致的疼痛模型的疼痛持續狀態的維持機制不同。其可能機制是：小膠質細胞活化后能分泌興奮性氨基酸、白介素 -1β、白介素 -6、腫瘤壞死因子 -α 和前列腺素 E2，這些介質可以使神經元興奮性增高，產生中樞敏化；中樞敏化后神經元又會產生大量的 ATP、P 物質、谷氨酸等，繼續激活小膠質細胞，構成一個小膠質細胞激活和中樞敏化相互作用的回路。進一步的研究將應用小膠質細胞特異抑制劑米諾環素進行干預，以明確小膠質細胞與功能性慢性內臟痛的相關性。
綜上所述：脊髓小膠質細胞活化參與新生期結直腸擴張大鼠由幼年到成年內臟高敏的維持過程?！緢D表略】
