miRNA 是一類長度為 18 ~ 22 個核苷酸的非蛋白編碼的單鏈小分子 RNA,廣泛存在于真菌、細菌、病毒、植物、哺乳動物等生物體內.miRNA 通過調控基因的表達參與細胞的早期發育、細胞增殖、細胞代謝、細胞凋亡等重要的生命過程.近幾年,多種生物體液中發現了能穩定存在的 miRNA.血漿、尿液或其他體液中細胞外 miRNA 的異常表達與包括腫瘤在內許多種疾病有著密切關系.然而,目前有關miRNA 進入體液的具體分子機制尚不清楚.本文僅就細胞外 miRNA 的發現、來源及其生物學功能方面做一綜述.
一、細胞外 miRNA 的發現
最早發現在生物體液中存在 miRNA 的是 Chim及其研究團隊.2008 年,Chim 等[1]在研究中發現,孕期女性的血漿中有來自胎盤的 miRNA,確認了孕體血漿中 157 種 miRNA,其中 17 種 miRNA 在血漿中的濃度是孕婦外周血細胞的 10 倍以上并且在產后孕婦血漿中無法檢測到.同年,Lawrie 等[2]在彌散性 B 細胞淋巴瘤患者的血漿中檢出 miR-155、miR-210 和 miR-21a 這三種腫瘤相關的 miRNA 表達水平比正常對照組有升高,并據此提出將循環 miR-NA 作為疾病甚至腫瘤診斷標志物的設想.隨后,Weber 等[3]在血漿、唾液、淚液、尿液、羊膜液、初乳、乳汁、支氣管液、腦脊液、腹膜液、胸膜液、精液共 12種正常人體液中檢測 miRNA 的存在,結果顯示miRNA 在以上 12 種體液中都得以檢出,說明 miR-NA 存在于人體多種體液之中.Zhang 等[4]以身體健康的中國人\\( 主食為稻米\\) 為研究對象在其血清與血漿中檢測到了外源性的植物 miRNA,同時在其他動物的血清中也檢測到了植物 miRNA.
二、細胞外 miRNA 的來源與運送途徑在生物體內的過程
\\( 一\\) 細胞外 miRNA 的來源 血細胞與血漿完全接觸,即使很小的血細胞數的變動或者細胞溶血的發生都會改變血漿 miRNA 的水平,許多被認為可以作為腫瘤標志物的循環 miRNA 在血細胞中的呈現高表達,因此,可以將血細胞認為是血漿中細胞外miRNA 的主要來源[5].然而,最近一項研究將AGO1 和 AGO2\\( Argonaute\\) 相關的血漿 miRNA 與全血細胞 miRNA 進行對比分析,結果顯示在正常情況下血漿 miRNA 也可以來自其他組織器官[6].某些組織特異性的 miRNA,如 miR-122\\( 肝臟\\) 、miR-133a\\( 肌肉\\) 、miR-208a\\( 心臟\\) 以及 miR-124\\( 腦\\) 都已經在血漿中被檢出.
腫瘤也能向血液中釋放 miRNA.在腫瘤的不同階段都可以在血液循環中發現多種腫瘤組織特異性 miRNA.并且腫瘤向其他細胞一樣可以分泌包含 miRNA 的微囊泡\\( microvesicles,MVs\\) .Mitchell等[7]將人前列腺癌細胞種植在小鼠體內,發現來自于人前列腺癌的異種移植物可進入種植小鼠的體內循環,證實了體液中的 miRNA 不僅來源于宿主細胞\\( 小鼠\\) ,還有一部分是由腫瘤細胞分泌.
Zhang 等[4]研究發現人工喂以稻米、小麥、馬鈴薯等植物的小鼠在喂食后血清中植物 miR-168a 至少是喂食前的 3 倍,并且在肝臟、胃腸等臟器中發現該 miRNA 水平皆有明顯增高,而在腎臟等其他器官中并未檢測到此種變化,說明植物 miRNA 通過哺乳動物的攝食行為進入機體內部,通過胃腸道進入血液,這是目前發現的唯一的外源性植物 miRNA 進入機體的方式,也是細胞外 miRNA 的來源之一.
\\( 二\\) 細胞外 miRNA 的穩定性 研究者將核糖核酸酶加入新鮮人血清后檢測 miRNA 的量并不會減少,說明血漿 miRNA 可在富核糖核酸酶的環境中較為穩定地存在.向血清中加入外源性成熟 miR-NA 則發現外源性 miRNA 在核糖核酸酶的作用下迅速降解.而在加有核糖核酸酶抑制劑的血清中外源性 miRNA 則不會降解.這也揭示了 miRNA 本身并不具有對核糖核酸酶的抗性,為研究者進一步探索miRNA 在體液中的存在形式提供了思路.
\\( 三\\) 細胞外 miRNA 在生物體內的運送過程在體液中發現 miRNA 之前,研究人員在細胞培養基中已經發現釋放到細胞外的胞外體\\( exosome\\) 中含有 miRNA.機體中的 miRNA 可以通過囊化進入MVs 從而到達細胞外.而后,Hunter 等人在提純的人外周血 MVs 中檢測出了 miRNA,進一步證實了膜-囊泡結構保護 miRNA 的假設[8].Gibbing 等[9]研究發現 miRNA 包裹入胞外體可能不是一個隨機事件,而是由特異性蛋白控制的; RNA 誘導的沉默復合體中的一個組分 GW182 在胞外體中表達極其豐富.而 GW182 是 miRNA 與 Ago2 相互作用發揮功能所必須的.胞外體被包裹進入 MVB 與神經酰胺有關.胞外體中含有大量的鞘磷脂及神經酰胺,而神經酰胺的合成受到中性鞘磷脂酶 2 \\( neutralsphingomyelinase 2,nSMase2 \\) 的控制.另有研究表明含有 miRNA 的胞外體進入 MVs,并由神經酰胺觸發釋放到細胞外.過表達 nSMase2 可以增加細胞外miRNA 的分泌,而使用特異性小干擾 RNA 或化學物質抑制 nSMase2 的酶活性則明顯降低 miRNA 的分泌水平\\( Kosaka 等. 2010\\) .然而,Galas 等[10]研究顯示 MVs 包裹并不是 miRNA 進入細胞外的唯一途徑.在人工培養細胞的培養液中收集的 miRNA 大多數并不是來自于脫落囊泡和胞外體.同年,兩篇研究性文章各自證實了大部分細胞外 miRNA 不僅和膜-囊泡結構無關而且 AGO 蛋白有關.在去除細胞碎片的血漿中只有很小一部分的 miRNA 與 MVs相關,90% ~95% 的 miRNA 是以和 AGO 蛋白結合的形式存在\\( Arroyo 等. 2011\\) .正常條件下人工培養的細胞所分泌的 miRNA 99% 左右與膜囊并無關系,而是同 AGO 蛋白結合\\( Turchinovich 等. 2011\\) .外源性 miRNA 由于其發現尚存在較大爭議,目前也沒有更多研究闡述其在生物體內的詳細的轉運過程.miRNA 進入受體細胞的方式仍不清楚,目前認為 MVs 可由內吞、內化等方式被受體細胞接受,而由 MVs 包裹的 miRNA 很可能借由這些過程進入受體細胞.
三、細胞外 miRNA 的生物學作用
\\( 一\\) 內源性細胞外 miRNA 的生物學作用
1. 胞外體介導的細胞間通訊: Zhang 等[11]研究發現 MVs 中的 miRNA 由循環進入靶細胞作為內源性 miRNA 調節多種靶基因或者信號事件.用人微血管內皮細胞系\\( HMEC-1\\) 作為受體細胞,含有來源于 THP-1 細胞 FITC 標記的 miR-150 的 MVs 能夠進入 HMEC-1 細胞,miR-150 表達水平明顯升高.
這一結果表明 miRNA 可以通過 MVs 傳遞到遠處靶細胞.miRNA-150 過表達后,293T 細胞的培養上清中的 MVs 能使 HMEC-1 細胞中 c-Myb 蛋白的表達明顯降低,HMEC-1 細胞的遷移能力增加.沉默THP-1 細胞內 miR-150 的表達,則發現缺乏 miR-150的 MVs 并不影響 HMEC-1 細胞中的 c-Myb 蛋白表達及 HMEC-1 細胞的遷移能力.采用 Dil-C16 標記THP-1 細胞來源的 MVs 經尾靜脈注射給 C57BL /6小鼠,血管內皮層中 miR-150 表達水平明顯升高.
動脈粥樣硬化患者血漿中分離出的 MVs 中 miR-150水平較正常人升高,而這種患者的 MVs 可以使HMEC-1 細胞中 c-Myb 蛋白的表達明顯降低,促進HMEC-1 細胞的遷移.這些結果表明病理狀態下MV 中攜帶的分泌性 miRNA 可以到達受體細胞和組織發揮功能.
Pegtel 等[12]研究發現胞外體 miRNA 可以促進病毒感染.用 EB 病毒轉化來源于 B 淋巴樣干細胞的胞外體,通過體外共同培養實驗病毒 miRNA 通過分泌的胞外體傳遞到未感染的細胞,并使 EVB-miR-NA 的靶基因 CXCL 的表達呈現出劑量依賴性抑制.
進一步對 EB 病毒負荷增加的人群的外周血進行分析發現,EB 病毒 DNA 僅存在于循環 B 細胞中,而EB 病毒 miRNA 卻在 B 細胞及非 B 細胞同時出現,這也提示了循環 miRNA 可以進行細胞間的傳遞.Mittelbrunn 等[13]研究發現胞外體 miRNA 也參與免疫應答的調控.J77 T 細胞、Raji B 細胞及原代的樹突狀細胞分泌的胞外體中含有 miRNA,經抗原刺激可以誘導免疫突觸的形成,促進 miRNA 從 T 細胞向抗原遞呈細胞\\( antigen presenting cell,APC\\) 的單向性轉移.而 miRNA-335 可以抑制 APC 中 SOX4mRNA 的翻譯,進一步證實了轉移到 APC 中的 miR-NA 在受體細胞中是有生物學功能的,揭示了由胞外體介導的抗原驅動的單向性細胞間 miRNA 的轉移機制,而 miRNA 這種在免疫細胞之間的轉移則可能會在免疫細胞之間信號傳遞,甚至在在免疫反應中調節基因表達.
此外,研究表明在體外 miR-133b 可以通過胞外體由間充質干細胞轉移到星形膠質細胞和神經細胞.腫瘤細胞分泌的 miRNA 可能會影響周圍正常細胞的表達譜,從而影響腫瘤進展,但尚未在體內試驗進行驗證.
2. 特異的循環 miRNA 表達譜可作為腫瘤及其他疾病的新型生物標記物: 已有研究報道某些生理病理條件下可能會得到較為獨特的循環 miRNA 譜.由于細胞外 miRNA 可在血漿、血清中穩定存在,可考慮以不同血清 miRNA 作為不同疾病的標記物.Chen 等[14]將 11 個非小細胞肺癌患者\\( non-smallcell lung cancer,NSCLC\\) 的血清進行匯集測序,并與正常人的血清 miRNA 進行對比,發現 NSCLC 患者的血清出現 63 種不存在于比正常人血清中的 miR-NA,而 28 種正常人血清 miRNA 也未能在 NSCLC 患者的血清中檢出.NSCLC 患者的血清 miRNA 表達譜同時與血細胞 miRNA 表達譜進行比較,發現兩者共有的 miRNA 有 57 種.而 76 種 miRNA 僅在NSCLC 患者的血清中檢出,這一結果同正常人血清miRNA 與血細胞 miRNA 表達譜的比較結果差異較大.他們進一步對結腸癌和糖尿病患者的血清miRNA 進行了測序,發現在結腸癌患者血清中發現了 69 種正常血清中為檢測到的 miRNA,值得注意的是許多 miRNA,如 mi-134、mi-221 等在肺癌和結腸癌患者血清中都有發現,并且不存于正常人血清中,這一結果提示血清中可能存在某些腫瘤相關miRNA.
\\( 二\\) 外源性細胞外 miRNA 的生物學作用Zhang 等[4]發現外源性的植物 miR-168a 可以被小鼠消化道吸收,進入血循環及胃、小腸、肝臟等多種臟器,與靶基因低密度脂蛋白受體銜接蛋白 1\\( low-density lipoprotein receptor adapter protein 1,LDLRAP1\\) 結合,從而抑制其在肝臟中的表達,減緩低密度脂蛋白從血漿中的清除.在人類小腸上皮細胞 Caco-2 中高表達 miR168a,并用 Caco-2 的 MV 處理 HepG2,結果發現 HepG2 細胞中 miR-168a 水平也有升高,而 LDLRAP1 的蛋白水平降低.這一研究結果表明外源性植物 miRNA 可以通過哺乳動物的攝食行為進入其體內,調控靶基因表達從而影響攝食者的生理功能.
四、結語與展望
目前研究已經證實細胞外 miRNA 能夠在血清中穩定存在,并且廣泛存在于人體 12 種體液中.細胞外 miRNA 由體內細胞分泌或通過攝食行為由胃腸道吸收,進入循環中,被靶細胞攝取,調節靶基因或信號事件,起到了細胞間的通信作用.然而,還有許多關于細胞外 miRNA 的問題需要進行進一步的研究: miRNA 是否由細胞選擇性分泌,具體是如何進行分揀進入微囊泡中或與 AGO 等蛋白結合? 循環 miRNA 如何被靶細胞識別并攝取? 什么機制觸發了 miRNA 由遠端部位的釋放? 此外,研究 miR-NA 的終極目標在于對人類疾病的預測、預后以及治療上的價值.盡管目前這一研究領域仍處于探索階段,但相信其在細胞間通信以及疾病的診斷和治療都將產生重大影響.
參 考 文 獻
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