神經病理性疼痛\\(neuropathy pain,NPP\\)是由于感染、腫瘤和外傷等原因導致中樞或外周神經系[1,2]統損傷后所引起的一種慢性疼痛狀態 .由于其發病機制極其復雜,而且鎮痛藥物的治療效果較差,因此,NPP已經成為嚴重影響患者生存質量的臨床頑癥之一,而研制更為有效的治療手段也成為學者[3]們的研究熱點 .近年來的研究發現,微量元素鋅似[4]乎與NPP密切相關 .因此,為了深入研究鋅對NPP的影響,本文將c-fos蛋白和動物行為學作為觀察對象,利用原子吸收光譜技術、動物行為學檢測、免疫組化和圖像分析技術檢測鋅預處理對c-fos表達和動物行為學的影響,從而為揭示鋅影響NPP的機制提供理論依據.
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
兔抗小鼠多克隆c-fos抗體\\(cellsignaling公司\\);免疫組織化學染色試劑盒和DAB染色劑\\(福州邁新公司\\);辣椒素\\(Santa公司\\);光學顯微鏡、原子吸收光譜儀、von Frey刺激針和計算機圖像分析系統等.
1.2 動物分組與模型制備
48只C57/BL6小鼠,8周齡大,雌雄各24只,體重20~30g\\(北京維通利華實驗動物中心提供\\).將小鼠隨機分4組:采用右后足底注射辣椒素\\(0.5%,5μl\\)制備NPP模型.①對照組\\(Con\\):給予適鋅飼料\\(鋅30mg/kg/d\\)喂養2周后,右側后足底注射溶劑\\(吐溫80、酒精和生理鹽水混合液\\);②適鋅喂養組\\(N-NPP\\):給予適鋅飼料\\(鋅30mg/kg/d\\)喂養2周后足底注射辣椒素;③低鋅喂養組\\(L-NPP\\):給予低鋅飼料\\(鋅0.85mg/kg/d\\)喂養2周后注射辣椒素;④高鋅喂養組\\(H-NPP\\)給予硫酸鋅水溶液\\(227mg/L/d\\)喂養2周后注射辣椒素.
1.3 取材與標本制備、動物自主行為學觀察
注射辣椒素后第7天,將小鼠用4%戊巴比妥鈉\\(50mg/kg\\)腹腔麻醉后,取腰5節段的脊髓,一部分稱重后,-80℃保存,用于原子吸收光譜技術檢測;另一部分放入4%多聚甲醛溶液固定12h,常規脫水、透明、浸蠟、包埋,制備5μm厚的石蠟切片,用于免疫組織化學染色.
從注射辣椒素前2天開始,每天觀察小鼠的行為學變化,觀察有無跛行、注射側后足不敢著地負重、舔足、咬足、足部畸形、自噬、離地時間延長等現象,一直觀察到注射辣椒素后第7天.
1.4 機械痛閾檢測、原子吸收光譜技術
注射辣椒素前2天和注射后第7天,將小鼠放在圍有透明玻璃的金屬網眼平臺上,等動物適應環境后,用von Frey刺激動物右后足底.動物出現縮足和快速甩足等動作時認為是有反應;刺激針彎成90度而動物沒有抬足等反應則認為是無反應.10次當中出現5次以上的縮足反應者視作陽性,機械性痛閾[5]\\(g\\)就是能引起縮足反應的最小力度 .足底注射辣椒素后第7天,取血清和脊髓組織.血清加入三氯醋酸,3000r/min離心5min,取上清;脊髓組織經混合酸浸泡過夜后消化,利用原子吸收光譜分析法測定鋅含量.
1.5 免疫組織化學染色、圖像分析
石蠟切片常規脫蠟入水,用微波進行修復.經3%H O 孵育10min,以封閉內源性過氧化物酶;0.01M2 2PBS沖洗,5min×3次;用正常非免疫動物血清孵育10min;甩掉血清,加入兔抗小鼠多克隆c-fos抗體\\(1: 200\\),在4℃下孵育過夜;0.01M PBS沖洗,5min×3次;加入山羊抗兔IgG\\(1: 200\\),室溫下孵育10min;0.01M PBS沖洗,5min×3次;加入鏈霉素抗生物素-過氧化物酶孵育10min;0.01M PBS沖洗,5min×3次;用DAB顯色5min,入水中止反應.切片常規脫水、透明和封片,光鏡下進行觀察.用正常非免疫動物血清代替一抗作為陰性對照.
用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統對免疫組化結果進行圖像分析.每個樣本選取5張切片,每張切片于400倍光鏡下系統隨機選取3個視野進行檢測,計算平均光密度值\\(average optical,AO\\).
統計學分析應用SPSS19.0軟件進行統計處理,實驗數據用均數±標準差表示,采用單因素方差分析\\(ANOVA\\)方法進行數據分析, P<0.05為差異有統計學意義.
2 結果
2.1 原子吸收光譜檢測結果
在注射辣椒素后7d,正常喂養組動物血清鋅和脊髓中的鋅含量均顯著減少\\( P<0.01\\).低鋅喂養組動物血清鋅和脊髓鋅的含量更低;而高鋅喂養組動物的血清鋅和脊髓鋅含量最高P <0.01,圖1 2\\).
2.2 小鼠行為學變化
足底注射辣椒素后第1天小鼠即出現注射側后足跛行、不敢負重、經常將后足縮至腹部或拖著后足行走,傷側腳趾外翻并攏,經常舔足或甩足,活動度減少,明顯不如注射之前活躍,這種行為一直持續到觀察期末.其中,低鋅喂養組\\(L-NPP\\)小鼠行為學改變最為嚴重,而高鋅喂養組\\(H-NPP\\)小鼠的行為學改變最輕.機械痛閾檢測顯示:各組動物注射辣椒素后7天的機械痛閾顯著降低,痛敏增強\\( P<0.01\\).其中,L-NPP組的機械痛閾最低,而H-NPP組的痛閾最高\\( P<0.01,圖3\\).
2.3 免疫組化染色結果
c-fos免疫組織化學陽性產物呈棕褐色顆粒狀,主要表達在脊髓神經元的細胞核上.對照組動物在脊髓后角淺層有少量的陽性表達產物,陽性細胞較少.與對照組相比,其它三組NPP動物的c-fos陽性表達均增多,陽性細胞密集,平均光密度\\(AO\\)值增高\\( P<0.01\\).其中,L-NPP組的陽性顆粒和陽性細胞最密集,AO值最高;H-NPP組的陽性顆粒和陽性細胞最稀疏,AO值最低\\( P<0.01,圖4,5\\).
3 討論
神經病理性疼痛是由神經系統受損傷所引發的一種慢性疾病,其發病原因多樣, 包括:糖尿病等代謝系統疾病所引發的神經痛、腫瘤侵襲等引發的神經痛、腦和脊髓外傷等引起的中樞神經系統損傷、[6-7]病毒感染和放化療所引發的神經痛并發癥等 .患者的主要臨床病理生理學表現是:痛覺過敏、痛覺超敏、自發性疼痛和異位痛等.近年來,由于社會老齡化日益嚴重,而且癌癥等疾病的生存率逐年提[8]高,導致NPP的發病率顯著增加, 高達1%左右 .由于這種疼痛劇烈而持久,可持續數周、數月甚至數年,臨床上缺乏有效的治療方法,藥物治療往往還伴隨著成癮性等問題,因此,NPP已經成為學者們密切關注的一大頑癥,而深入探討NPP的發病機制,尋找有效的治療靶點勢在必行.
研究發現,鋅是機體的一種重要的微量元素,[9]其廣泛分布于機體的各種組織和器官 ,在中樞和外周神經系統中的分布尤其豐富,其中,游離狀態的[10]鋅在神經傳導活動中發揮著極其重要的調控作用 .[4]Nozaki等 發現,鋅是病理性疼痛的一種內源性的抑制劑,能抑制在興奮性傳導過程中起重要作用的NMDA受體,其與病理性疼痛的形成與傳導密切相[11]關.有報道稱 ,神經損傷后,脊髓后角淺層的鋅離子顯著減少,伴隨動物的機械性痛閾降低,動物出現痛覺過敏現象,提示鋅可能參與了痛覺的產生與傳導.另有研究發現,鋅能抑制對NPP的產生具[12]有促進作用的P物質在脊髓的表達 ;此外,鋅也能使痛閾升高,降低痛敏,提示鋅可能對病理性疼痛[13]具有抑制作用 .本研究結果與之前的研究相符,我們利用原子吸收光譜技術和動物行為學觀察發現,NPP后,動物血清和脊髓中的鋅含量顯著減少,動物的機械痛閾降低,痛敏增強.高鋅喂養能改善血清和脊髓中的缺鋅狀態,提高機械痛閾值,減輕痛敏;而低鋅喂養則加重血清和脊髓中的缺鋅狀態,降低機械痛閾值,促進痛覺過敏,提示,鋅對病理性疼痛具有抑制作用.
那么鋅是如何抑制病理性疼痛的呢?研究發現,原癌基因c-fos作為一種即刻早期基因,它能被第二信使誘導,參與細胞內信息傳遞過程,在NPP時的表達顯著增多,是神經元激活的標志,也[14]是痛覺過敏狀態發展的反映 .研究發現,在甲醛引起的炎性痛模型中,c-fos蛋白在脊髓表達上調,[15]熱痛閾降低 ;鞘內給予c-fos反義寡核苷酸探針能顯著抑制福爾馬林和腰5脊神經結扎誘導的大鼠腰髓背角c-fos陽性神經元的增加,提示c-fos的活化對于病理性疼痛的發展有顯著意義,而抑制其活化能緩[16]解慢性疼痛 .本研究中,我們發現,對照組動物在脊髓后角淺層c-fos只有少量陽性表達,陽性細胞較少.注射辣椒素后,脊髓后角c-fos陽性表達顯著增多,陽性細胞密集,AO值增高.高鋅喂養能使c-fos的表達顯著下調,AO值降低;而低鋅喂養能使c-fos的表達更多,AO值增高,我們推測鋅可能通過降低脊髓后角原癌基因c-fos的表達從而抑制了病理性疼痛的產生與傳導,進而使動物的機械痛閾顯著增高,痛敏降低.盡管我們的研究結果為研究鋅參與NPP的機制提供了一定的理論數據,但是,鋅是通過怎樣的機制來抑制c-fos的表達?鋅是否還通過其它的機制參與NPP的傳導?這些都有待于我們更深入的研究.
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