病理性疼痛的一個重要分類是炎癥性痛.炎性痛是是由各種生物\\(細菌、真菌、病毒等\\)、物理、化學或免疫源性炎癥在細胞水平對組織完整性所造成的損傷.它的發生發展與組織損傷和炎癥的[1]產生密切相關 .福爾馬林模型是一個公認的誘導炎性痛的理想模型,福爾馬林經過一定倍數的稀釋后,注射于小鼠或大鼠后足掌部皮下,可提供一個持續的傷害性刺激,從而激發一種明顯的、彌散[2]的、長時間持續的自發性疼痛行為反應 .研究顯示,在小鼠福爾馬林疼痛模型中,脊髓谷氨酸\\(glutamate,[3]Glu\\)水平顯著增高 .Glu作為一種興奮性神經遞質,是誘發疼痛形成和持續的重要因素.
星形膠質細胞\\(Astrocytes,AS\\)作為中樞神經系統中,數量最多、體積最大的一類膠質細胞,在維持神經元內外環境、生存、遷移、免疫調節、信號轉導、等方面具有重要作用.特別是,AS通過谷[4]氨酸-谷氨酰胺循環來調控谷氨酸的傳遞 .AS通過其膜上特異性谷氨酸轉運體1\\(glutamate transporter1, GLT1\\)和谷氨酸天冬氨酸轉運體\\(glutamateaspartatetransporter,GLAST\\)將突觸間隙中的Glu攝入,并由谷氨酰胺合成酶\\(glutamine synthetase, GS\\)轉化為谷氨酰胺輸送回神經元,從而有效維持持續的谷氨酸能突觸傳遞和保護突觸后神經元免受興奮性毒性損害.研究證實,在福爾馬林致炎性痛模型中存在[5]脊髓AS的激活,提示AS參與了炎性痛的過程 .然而,在此模型中,活化的AS是否增強對Glu再攝取和轉化,進而參與痛覺的調控尚未見報道.
綜合以上研究背景,本實驗選擇福爾馬林制備炎性痛模型,通過觀察脊髓后角膠質纖維酸性蛋白\\(glial fibrillary acidic protein, GFAP\\), GLT1, GLAST和GS表達的變化,以探討脊髓后角AS參與痛覺調節的作用機制.
1 材料和方法
1.1 動物分組及模型制作
健康的雄性ICR小鼠20只\\(南京醫科大學動物中心提供\\),體重26-28g.動物隨機分為2組.①模[6]型組:在安靜、自然光環境下,按文獻 方法復制炎性痛模型,用微量注射器在小鼠右后足背皮下注射2.5%的福爾馬林40μl.②對照組:動物行40μl生理鹽水后肢足背注射.60min后,小鼠行斷頭術處死,快速取脊髓L4-L5節段,于冰盤中快速分離脊髓背側,-20℃保存待用.兔抗GFAP抗體、兔抗GS抗體、兔抗GLT-1抗體和兔抗GLAST抗體均購于武漢博士德公司,Glu定量檢測試劑盒由南京建成生物研究所提供.
1.2 Glu檢測試劑盒檢測生化指標
利用南京建成生物研究所提供Glu檢測試劑盒,測定L4-L5節段脊髓后角中Glu的含量,操作步驟嚴格按照試劑盒說明進行.
1.3 Western blot檢測
取兩組小鼠組織,進行蛋白提取和濃度測定.10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白結束后,轉移槽轉移蛋白質到PVDF膜.轉移后的PVDF膜用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫包被2h后,浸入含5%脫脂奶粉的TBST稀釋的一抗\\(GFAP,1 1000;GS,1:500,GLT-1,1:1000,GLAST,1:1000\\)中 ,4℃過夜,TBST漂洗后轉入用5%脫脂奶粉的TBST稀釋的HRP偶聯的二抗\\(1:1000\\)中,室溫2h,TBST充分漂洗后,ECL發光系統檢測目的蛋白及GAPDH的蛋白表達水平.本部分實驗重復3次.吸光度值測定應用Leica全自動圖像分析儀測定,以目的蛋白的光密度值\\(OD\\)與內參OD的比值作為目的蛋白相對光密度值.
1.4 統計學分析
數據用均數±標準誤\\(X±S.E.M.\\)表示.采用t檢驗進行組間數據比較.P < 0.05被認為存在顯著性差異.
2 結果
2.1 脊髓后角Glu含量的測定
與對照組相比,模型組脊髓后角Glu含量顯著升高\\(圖1\\)
2.2 GFAP、GLT1、GLAST和GS在脊髓的表達
Western-blot檢測結果顯示,與對照組相比,模型組脊髓后角內GFAP, GLT1,GS和GLAST蛋白水平升高,差異有顯著性\\(圖2\\).
3 討論
為了研究炎性痛的機制,通常通過小鼠或大鼠后足注射炎性物質制作炎性痛覺過敏模型來模擬患者臨床疼痛癥狀.目前,福爾馬林致痛模型是一個較好的用于研究急性組織損傷所致持續性炎性痛的[2]動物模型 .Glu是中樞神經系統主要的興奮性氨基酸神經遞質,因傷害性刺激、組織損傷或神經損傷而釋放.福爾馬林引起的組織損傷和炎癥使脊髓Glu釋放增加,神經元興奮性增高,興奮閾值降低,[7]引起中樞敏化和疼痛過敏 .本實驗中,脊髓后角Glu含量的增高也證實了這一觀點.
目前,越來越多的研究表明AS在中樞敏化方面具有關鍵性作用,特別是AS通過谷氨酸-谷氨酰胺循環對Glu起重要調節作用 .AS通過Glu轉運體攝取了突觸間隙中80%的Glu,并通過GS催化,轉變成谷氨酰胺,再轉運到神經末梢,重新生成Glu.本研究中,我們檢測到脊髓后角AS蛋白表達上升,這一結[9]果較之既往僅觀察AS形態的改變 ,從蛋白水平進一步證實了在此模型中,存在脊髓AS的激活.GLAST和GLT1選擇性分布在AS細胞膜上,GS在[4]脊髓也主要存在于AS內 .研究表明,藥物封閉AS上Glu轉運體會導致疼痛過敏并增強脊髓后角神經元對[10]于外周機械以及熱刺激的反應性 .而下調Glu轉運[11]體的表達也與痛覺增敏相關 .本實驗結果顯示,脊髓后角內Glu轉運體GLT1、GLAST均有不同程度升高.這可能是在高濃度Glu的刺激下,AS通過上調GLT-1和GLAST來增強Glu攝取能力,以便維持細胞外低水平的Glu濃度和阻止Glu興奮性毒性.
Glu在突觸間隙濃度的維持還依賴于GS的作用.Glu被細胞攝取后,必須經過GS轉化為谷氨酰胺才失去其毒性作用.研究顯示,應用GS抑制劑后,阻斷了谷氨酸-谷氨酰胺循環通路,降低了Glu攝取率,[12]從而產生細胞毒性 .本實驗中,模型組增高的GS,不僅清除了AS攝取的Glu,而且為神經元提供了更多的合成Glu的原料谷氨酰胺,從而維持了突觸末梢Glu的持續釋放.
總之,本實驗首次闡明在福爾馬林致炎性痛模型中,脊髓AS通過谷氨酸-谷氨酰胺循環參與疼痛傳遞的調節.根據此結果推測,在持續性炎性痛中,應用針對谷氨酸轉運體、或者GS的藥物不失為一種新的治療方法.
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