氟廣泛存在于地球上,是機體必需的微量元素之一,適量的氟有利于維持機體鈣磷代謝和保持神經興奮的傳導。但過多攝入可導致肝腎等多種組織器官的廣泛損傷。前期實驗表明,過量氟化物導致大鼠肝細胞 DNA 損傷,并可誘導細胞凋亡,本研究觀察氟化物對肝組織 caspase-3、caspase-9 基因表達水平,明確氟化物導致大鼠肝細胞 DNA 損傷并誘導細胞凋亡是否與 caspase-3、caspase-9 基因表達水平有關,進一步了解氟化物對肝組織損傷機制。
1、 材料與方法
1. 1 主要試劑和儀器
RNAiso Plus 總 RNA 提取試劑\\(TaKaRa 公司\\) 、5 × PrimeScript \ue4d1 RT Master Mix 試劑盒\\(大連寶生物工程有限公司\\) 、反轉錄 SYBRPremix \ue4d1 Ex TaqTMII 試劑盒 9 \\(大連寶生物工程有限公司 \\) 、DNAMarker\\(大連寶生物工程有限公司\\) 、瓊脂粉\\(西班牙\\) 、高速冷凍離心機 3 - 18K\\(美國 Sigma 公司\\) 、PTC - 200PCR 儀\\(美國 Bio - Rad 公司\\) 、ABI 7300全自動熒光定量 PCR\\(美國 ABI 公司\\) 、可調微量移液器\\(德國 eppendorf 公司\\) 。
1. 2 動物分組、肝系數測定及標本的采集
清潔級雄性 SD 大鼠 48 只,體重\\(100 ± 10\\) g,由山西醫科大學實驗動物中心提供,合格證號:SCXK\\(晉\\) 2009 - 0001。將 SD 大鼠觀察 1 周適應環境后,隨機分為 4 組,每組 12 只,各組均飼喂大鼠正常飼料,對照組、低氟組、中氟組和高氟組分別自由飲用含 0,50,100,200 ㎎/L 氟化鈉去離子水。動物飼養于山西醫科大學實驗動物中心屏障環境[SYXK\\(晉\\) 2009 -0001],每月測定實驗動物體重,觀察體重變化,染毒 120 d。染毒結束,稱量最后一次體重,麻醉后經右心灌注生理鹽水,沖洗肝內血液,快速對大鼠的肝組織進行取材,用濾紙吸干表面血液,稱重,測定肝系數[肝系數 = 肝質量\\(g\\) /體質量\\(g\\) × 100%]。將肝組織迅速放入液氮中速凍,然后轉移至 - 80 ℃ 冰箱保存,以備實時熒光定量PCR 檢測。
1. 3 肝組織中 caspase-3、caspase-9 基因表達的實時熒光定量 PCR 檢測
稱取低溫凍結的肝組織 100 mg 加液氮研磨成粉末狀,按 RNAiso Plus 試劑說明操作,提取總RNA,通過 1. 0% 瓊脂糖凝膠電泳進行肝組織總RNA 質量鑒定,核酸分析儀測量其濃度,用反轉錄試劑盒將其反轉錄為 cDNA。以 β-actin 作為內參照,caspase-3 上游引物: 5’- AGCCATGTACGTAGC-CATCC - 3’,下游引物: 5’- GGCGCAAAGTGACTG-GATGA - 3’,產物長度 147 bp; caspase-9 上游引物:5’- CTGAGCCAGATGCTGTCCCATA- 3’,下游引物:5’- GACACCATCCAAGGTCTCGATGTA- 3’,產物長度 176 bp; β- actin 上游引物: 5’-AGCCATGTACG-TAGCCATCC- 3’,下游引物: 5’- ACCCTCATAGAT-GGGCACAG- 3’,產物長度 115 bp。然后進行擴增:95 ℃ 30 s; 然后 95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40 個循環,添加溶解曲線,反應結束后,電腦自動輸出溶解曲線及對應 Q 值\\(達到閾值循環數\\) 和擴增曲線。取 6 μlPCR 產物經 2% 瓊脂糖進行凝膠電泳,采用凝膠成像系統觀察,以進行 PCR 產物鑒定。
1. 4 實驗數據處理及分析
相對表達量比較采用 2- ΔΔCt法分析,表示實驗組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數。ΔCt\\(染氟組\\) = Ct\\(目的基因\\) - Ct\\(內參基因\\) ; ΔCt\\(對照組\\) = Ct\\(目的基因\\) - Ct\\(內參基因\\) ; ΔΔCt =ΔCt\\(染氟組\\) - ΔCt\\(對照組\\) 。目的基因的相對表達水平 =2- ΔΔCt。
樣品的閾值線設置相同,采用 SPSS13. 0 統計軟件計算重復樣品間 Ct 均值及標準偏差,應用 2- ΔΔCt法處理數據。
1. 5 統計學分析
實驗數據采用 SPSS 16. 0 統計軟件進行分析,組間比較采用單因素方差分析及 LSD - t 法檢驗。
2、 結果
2. 1 不同染氟時期大鼠的體重變化
從表 1 可知,染氟過程中各組大鼠生長發育良好,體重均明顯增加。經統計分析,不同時期各染氟組體重與相應的對照組相比,差異無統計學意義,各染氟組之間體重兩兩比較差異也無統計學意義。
2. 2 氟對各組大鼠肝臟臟器系數的影響
從表 2 可知,染氟組大鼠肝臟臟器系數與對照組相比,差異無統計學意義; 各染氟組間比較差異也無統計學意義。
2. 3 肝臟組織總 RNA 的濃度和純度
大鼠肝臟 RNA 經提取純化后,在 1. 0% 瓊脂糖凝膠電泳進行快速分析\\(15 V/cm\\) ,從圖可以看出,總 RNA 有明顯三條帶\\(5S,18S 和 28S\\) ,表明總RNA 的完整性較好,基本無降解。SD 大鼠肝組織總 RNA,吸光度 A260/ A280均在 1. 8 - 2. 0 之間,表明總 RNA 的純度達到了實驗要求\\(見圖 1\\) 。
2. 4 樣品擴增動力學曲線和溶解曲線分析
實驗組與對照組 SYBR GreenⅠ熒光定量 PCR溶解曲線所得的 caspase-3、caspase-9 擴增時的 Tm值非常均勻,并且峰值單一\\(見圖 2\\) ,說明沒有引物二聚體和非特異性條帶形成。由擴增曲線看出擴增曲線間距非常均一,平行性較好\\(見圖 2\\) ,說明目的基因與內參基因擴增效率一致,符合在不制作標準曲線的情況下進行相對定量的條件。
2. 5 目的基因 PCR 擴增產物的瓊脂糖凝膠水平電泳檢測
目的基因 PCR 擴增后,瓊脂糖凝膠電泳得caspase-3、caspase-9、β - actin 片段分別為 147 bp、176 bp、115 bp,確定為所需要的目的基因。
2. 6 氟對大鼠肝臟 caspase-3 基因和 caspase-9 基因表達的影響
相對定量分析表明,氟誘導大鼠肝臟細胞損傷,引起了 caspase-3 和 caspase-9 基因表達水平的改變\\(見表 3\\) ,低、中、高劑量組 caspase - 3 基因表達量分別是對照組的 0. 34 ±0. 10、1. 37 ±0. 43 和2. 27 ±0. 73 倍,其中高氟組表達顯著增高 \\(P < 0. 05 \\) ;caspase-9 的基因表達量分別是對照組的 1. 03 ±0. 36、3. 05 ± 0. 68 和 5. 85 ± 0. 52倍,中氟組和高氟組表達顯著高于對照組\\(P <0. 05\\) 。
3、 討論
caspase 屬于半胱氨酸蛋白酶家族,其家族成員大部分是凋亡的啟動子或效應子,在細胞凋亡過程中發揮著重要作用。目前研究者發現的有 15 種caspase,根據 caspase 在級聯反應的上、下游所處位置和其功能的不同,把它分為三大類,第一類為凋亡始動子,它位于級聯反應的上游,它們是包括caspase-2、caspase-8、caspase-9 等,能在其他蛋白參與下發生自我活化并激活下游的 caspase。第二類是凋亡效應子,它位于級聯反應的下游,分別是caspase-3、caspase-6、caspase-7,它們能被上游的始動子激活,而激活后的 caspase 作用于那些特異性底物上,使細胞發生形態學及生化等改變,最終導致細胞凋亡等其他改變。第三類包括 caspase-1、caspase-4、caspase-5、caspase-13、caspase-14,此類 caspase 在細胞因子介導炎癥反應中發揮著主要作用,其次還在死亡受體介導的細胞凋亡途徑中起到輔助作用。
有研究表明,caspase 酶原可以通過以下幾種方式激活: 自活化\\(autoactivation\\) 、轉活化\\(transactiva-tion\\) 和非 caspase 蛋白酶活化 \\(activation by non -caspase proteinases\\) ; caspase 酶原在某種條件下有自活化的潛能,比如這種酶原在高濃度時可以自活化,把 caspase-2 的原域和 caspase-3 酶原融合起來,大大增強了酶原的自活化和 caspase-3 誘導的凋亡。caspase-9 能激活酶原 caspase-3 和 caspase-7,但不能激活 caspase-6,caspase-3 反過來可以再激活 caspase-9 及 caspase-8,這樣形成正反饋,即活化的 caspase-9 激活 caspase-3和 caspase-7,活化的caspase-3 反過來又能激活 caspase-9 酶原,形成正反饋通路。
本實驗采用實時熒光定量 PCR 技術對肝組織caspase-3 mRNA 和 caspase-9 mRNA 表達進行檢測發現,氟誘導大鼠肝臟細胞凋亡以及對肝細胞 DNA損傷的同時,引起了 caspase-3 和 caspase-9 mRNA 表達水平的增高,低劑量的氟對 caspase-3 mRNA 表達量較 caspase-9 mRNA 影響不顯著,中、高劑量的氟對 caspase-3 mRNA 和 caspase-9 mRNA 表達影響均很明顯,呈上升趨勢,特別是中、高劑量組的caspase-9 mRNA 表達量分別是對照組的 3. 05 ± 0.68、5. 85 ± 0. 52 倍。通過檢測大鼠體重及肝臟臟器系數,染氟組與對照組相比,體重及肝臟臟器系數差異均無統計學意義,說明氟對體重及臟器系數無明顯影響,可能是因為大鼠首次接觸外來物質需要一個適應過程,氟在該過程中對機體體重及臟器系數的影響可能未顯示出來。
綜上所述,氟引起的 caspase-3 mRNA 和caspase-9 mRNA 表達較對照組增高,高劑量組caspase-3 mRNA 和 caspase-9 mRNA 表達較中劑量組增 高,中、高劑量的氟對 caspase-3 mRNA 和caspase-9 mRNA 表達影響更大。根據以上實驗結果可以發現,低劑量氟進入大鼠肝組織內后,并不一定能立刻激活 caspase-9,隨著氟劑量的增大和染氟時間的延長,氟有可能引起一系列肝組織細胞因子的改變,激活 caspase-9,進而激活 caspase-3 最終導致肝組織細胞的損傷。由此推測氟對肝細胞 DNA損傷以及誘導細胞的凋亡,可能是通過激活caspase-3 和 caspase-9 而促進了細胞 DNA 損傷和凋亡的發生,當然,氟對大鼠肝組織的損傷作用及機制復雜,還有待更進一步探索。
參考文獻:
[1] 黃德遠,王丹,張秀慧,等. 高攝呂燃煤型氟中毒大鼠肝損傷干預效果分析[J]. 中國公共衛生,2010,6\\(3\\) : 290 -291.
