C1qTNF 相關蛋白\\(C1qTNF-related protein,CTRP\\)隸屬脂肪細胞因子家族,現已確定這個家族有15 個成員。其中的脂聯素已經具有將近 20 年的研究歷史,在肥胖、II 型糖尿病發生、胰島素抑制,以及在由肥胖引起的慢性炎癥發生過程中具有重要的作用,目前研究發現,在代謝與炎癥的交叉領域中,CTRP 家族發揮了非常重要的作用。

CTRP4\\(C1q TNF-related protein 4\\)是 CTRP 脂肪細胞因子家族成員之一,由本室與國家基因組北方中心利用反向生物學的方法,通過 DLR\\(dualluciferase report assay\\)平臺篩選出的對 NF-κB 通路具有明顯活化作用的一個功能未知的新基因。我們于 2011 年首次在國際上進行了報道。前期的研究發現人 CTRP4 重組蛋白在肝癌細胞系 HepG2 中可以上調 IL-6、TNFα 的表達,促進 STAT3 的磷酸化。還可以提高 HepG2 對化療藥的抵抗,促進細胞的克隆形成。

我們體外研究已經證明 CTRP4 具有多種重要功能,進一步研究該分子在體內的生理功能及病理作用是十分必要的。為了更深入研究 CTRP4 體內的作用和機制,我們構建了人 CTRP4 轉基因小鼠,并進行了鑒定,結果表明轉基因鼠的構建是成功的。

1、 材料和方法

1. 1 實驗動物

CTRP4 的轉基因小鼠購自中國醫學科學院醫學實驗動物研究所【SCXK\\(京\\)2009 -0004】。小鼠品系:C57BL/6J,使用級別為 SPF 級。用于交配的C57BL /6J 小鼠均購自維通利華公司【SCXK \\(京\\)2011 - 0012】,遺傳背景為表面分子 CD45. 2 陽性。

動物飼養環境:SPF 級,北京大學醫學部動物部【SYXK\\(京\\)2011 -0039】。

1. 2 實驗試劑

限制性內切酶 XbaI、XhoI 等購自 TaKaRa 公司,KpnI 等購自 NEB 公司;RevertAid First Strand cDNASynthesis Kit 購自 Fermentas 公司;基因特異性引物由北京擎科生物公司合成;硝酸纖維素膜\\(NC 膜\\)購自 Amersham-Pharmacia biotech 公 司; IRDTMye800-偶聯的抗鼠或抗兔的 IgG 二抗購自 LICORBioscience 公司;聚丙烯酰胺凝膠電泳 Marker 購自Fermentas;2TAQ PCR MASTERMIX 購自博邁德公司;RIPA 裂解液、PMSF 購自碧云天公司;鼠尾裂解液配方:1 mol/L Tris-HCl 5 mL;0. 5 mol/L EDTA2. 5 mL;NaCl 5. 844 g;10% SDS 25 mL。

1. 3 轉基因載體構建

真核細胞表達質粒 pcDNA3. 1-CTRP4-Myc/His由本室構建,pCAGGS 質粒由美國 Vanderbilt 大學吳冠青教授饋贈?？寺》桨钢?上下游引物具體序列分別為:CTRP4-PCAGGS-F: 5 ’-CCGCTCGAGATGCTGCCGCTTCTGCT-3’;CTRP4-PCAGGS-R: 5’-CCGCTCGAGTCAATGATGATGATGATG-3’。

1. 4 轉基因鼠的制備:

選用性成熟的野生型 C57BL/6J 雌性小鼠。腹腔依次注射孕馬血清\\(50 U/mL,0. 1 mL\\)及人絨毛膜促性腺激素\\(50 U/mL,0. 1 mL\\),置于單籠飼養的正常雄性小鼠籠內,取有精栓雌性小鼠輸卵管。受精卵置顯微鏡注射平臺 M2 液滴內,選有原核的受精卵為注射對象,用顯微鏡操作儀將有目的基因的線性化片段注入小鼠受精卵雄性原核中,再移植到 6 周齡 ICR孕母鼠輸卵管中,待其發育后產仔。此項工作由中國醫學科學院醫學實驗動物研究所完成。

1. 5 鼠尾基因組 DNA 提取

剪取鼠尾0. 5 cm 左右,用500μL 含有 0. 1 mg/mL 蛋白酶 K 的鼠尾裂解液 55℃ 裂解過夜,之后加入 300 μL 飽和 NaCl 冰浴 15 min,12000 r/min 轉速室溫離心 15 min,收上清后加入700 μL 異丙醇顛倒混勻直至形成絮狀沉淀,12000 r/min 室溫離心 15min 后棄上清加入 70% 乙醇洗滌沉淀,棄乙醇,晾干。50 μL 水 65℃溶解沉淀得鼠尾基因組 DNA。

1. 6 PCR 鑒定 CTRP4 轉基因小鼠

以 2. 5 中所述提取的鼠尾基因組 DNA 為模板,利用 pCAGGS 載體的啟動子序列 chicken β-actin 的特異性引物進行 PCR 擴增。在 10 μL PCR 體系中加入:2 × PCR Mix 5 μL,ddH2O 4 μL,PCR 上下游引物各 0. 2 μL,模板 DNA 0. 6 μL。反應條件為:94℃變性 5 min,進入循環\\(94℃變性 30 s,退火 58℃,30s,延伸 72℃,30 s\\)。共 35 個循環,最后一個循環在72℃ 延 伸 10 min,4℃ 保 存。 上 游 引 物 為: 5 ’-CCCATAGTAACGCCAATAGG-3’; 下游引物為 5 ’-GGGAGAGTGAAGCAGAACG-3’。取 5 μL PCR 產物進行 1%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠圖像分析系統分析結果。

1. 7 轉基因小鼠各個組織蛋白的提取

分離小鼠各器官組織,每種組織取 100 mg,用500 μL 的 RIPA 裂解液勻漿 20 s 后冰上裂解 30min,隨后 4℃離心,12000 r/min,20 min,吸取上清,BCA 定量法對裂解液進行蛋白定量。

1. 8 western blot 檢測 CTRP4 轉基因小鼠各個組織的表達

收集上一步的組織勻漿液上清,加入 SDS 加樣緩沖液,99℃ 加熱 10 min,經 12. 5% 聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳分離蛋白樣品后,將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上,5%脫脂牛奶封閉 2 h 后,用 TBS-T 以1∶ 800 比例配置 CTRP4 一抗,將膜與抗體封入雜交袋中,4℃ 過夜,之后用 TBS-T 洗膜三次,每次 10min,再加入相應的 IRDyeTM 800/700 標記的二抗避光反應 1 h,TBS-T 重復洗膜三次,最后用 OdysseyImaging System 儀器掃描成像分析。

1. 9 CTRP4 轉基因動物繁殖及純合子篩選

1. 9. 1 轉基因小鼠 F1 代的繁殖

我們將 CTRP4 轉基因鼠首建鼠\\(Founder\\)\\(雄性 5 只,雌性 8 只\\)分別與育齡期的野生型 C57BL/6J 小鼠交配,交配大約兩周之后觀測小鼠腹部并用指揉法判斷小鼠的胚胎情況,如果證實確已受孕,即把雌鼠分籠。小鼠一代生育的子鼠在 6 ~12 只左右,在 F1 代小鼠出生 12 d 左右對小鼠編號并鑒定小鼠的基因型,得到 CTRP4 雜合子轉基因小鼠,在4周時將新生小鼠離乳。

1. 9. 2 F2 代轉基因小鼠的繁育

用 F1 代鑒定陽性的 CTRP4 雜合子小鼠進行近親交配,即同窩陽性小鼠的雌雄交配,根據最適的雌雄比例\\(雄:雌 = 1:2\\)進行,編號及鑒定方法同F1 代。

1. 9. 3 F2 轉基因純合子小鼠的篩選

根據孟德爾遺傳定律,F2 代小鼠中有一定概率出現純合子,因此通過測交的方法來篩選 F2 代中的純合子小鼠,即把得到的每一只 CTRP4 陽性 F2代小鼠與野生型的 C57BL/6J 小鼠進行交配,通過子代小鼠判斷 F2 代小鼠是否為純合子,如果子代小鼠經過 PCR 鑒定 100%為 CTRP4 陽性,則表明親代小鼠為純合子小鼠,否則為雜合子小鼠。PCR 鑒定方法同 1. 6 中所述。

陰性鼠的來源:F1 代小鼠中的陰性小鼠進行交配,并大量繁殖,進而得到用于實驗對照的陰性小鼠。

2、 結果

2. 1 轉基因載體構建

以1. 3 中所述真核表達質粒 pcDNA3. 1-CTRP4-Myc / His 為模板,以 pCAGGS 質粒為載體進行轉基因載體構建,pCAGGS-CTRP4 質粒的構建方案基本過程如下:設計包含 Xho1 酶切序列的 CTRP4 基因特異性引物\\(即如 1. 3 中所述引物\\),以 pcDNA3. 1-CTRP4-Myc / HisB\\(-\\) 質粒為模板,PCR 擴增得到的片段連同真核表達載體 pCAGGS 采用同樣的限制性內切酶進行酶切。酶切產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離,切膠回收目的條帶?；厥盏妮d體和PCR 片段用 T4 DNA 連接酶連接,16℃ ,12 h。連接產物轉化入大腸桿菌 XL1-BLUE 中,使用 LA\\(Amp抗性\\)固體培養基培養 14 ~ 16 h,挑取克隆擴增培養,提質粒進行鑒定。鑒定是否有插入片段、插入片段的大小、片段插入的方向。對符合目的要求的陽性克隆進行質粒測序,測序結果與 NCBI 標準數據庫中的 CTRP4 CDS 序列進行比對,準確無誤后進行質粒大量提取,最終所得質粒結構如圖 1 所示。

質粒線性化,定量除菌后提供給中國醫學科學院醫學實驗動物研究所制作轉基因小鼠。

2. 2 轉基因小鼠的繁殖與鑒定

通過首建鼠和野生型 C57BL/6J 小鼠交配,得到 F1 代小鼠 135 只,經觀察雌雄比例并沒有異常,通過 1. 5 和 1. 6 中所述鑒定方法對 F1 代小鼠進行鑒定,經 1%瓊脂糖凝膠電泳,最終鑒定有 30 只陽性小鼠。以首建鼠 66 號為例。如圖 1A 所示,66 號小鼠所生子代\\(F1 代\\)12 只小鼠的 PCR 鑒定結果顯示,1 號和 6 號為陽性鼠。

隨后我們選擇 F1 代小鼠同窩并且至少有1 只雄性,1 只雌性的小鼠進行同窩交配,最終我們篩選出 4窩小鼠進行繁殖,以其中一窩 F1 代小鼠為例,如圖1B 所示,其生產的 7 只小鼠中 1 號和 6 號為陽性。

經過上述繁殖我們總共獲得28 只陽性 F2 代小鼠。通過 1. 9. 3 中所述測交方法鑒定,得到兩個品系純合子轉基因小鼠共 8 只。以其中一系純合子小鼠鑒定結果為例,圖 1C 中所示結果,F2 代 4 號小鼠與野生型小鼠交配生成的7 只 F3 代小鼠均為陽性,證實該轉基因小鼠為純合子。

2. 3 CTRP4 轉基因小鼠體內表達的鑒定

為了驗證外源 CTRP4 在小鼠體內的表達水平,我們取 CTRP4 純合子小鼠的心臟,肝,腦,腎等組織進行勻漿處理后 western blot 檢測 CTRP4 表達水平,同時取同窩陰性小鼠相應組織作對照,CTRP4 純合子小鼠表達水平在各組織中明顯高于同窩陰性小鼠。

2. 4 CTRP4 轉基因小鼠血生化分析結果

CTRP4 作為潛在的脂肪因子,很可能對機體的血糖血脂等具有調控作用。為了驗證這種猜測,我們對 CTRP4 轉基因小鼠進行了血生化檢測,包括血糖,膽固醇和甘油三酯三項,結果顯示轉基因小鼠體內血清膽固醇和血糖水平相對較低,如表 1 所示。

2. 5 CTRP4 轉基因小鼠體重曲線,脂肪比例與脂肪形態

CTRP 家族成員中有半數以上是脂肪因子,根據目前研究表明,脂肪因子有可能對機體體重、脂肪組織占體重比例以及脂肪細胞大小發揮一定的影響。為了檢測 CTRP4 是否具有類似的作用,我們檢測了 CTRP4 轉基因小鼠自出生后 16 周的體重變化,同時測量了其脂肪比例,觀察了脂肪 HE 染色結果。在正常飲食條件下,上述指標均沒有明顯變化。

3、 討論

脂肪細胞因子是一類在肥胖和由肥胖誘導的慢性炎癥過程中發揮重要作用的細胞因子,通過對代謝調控通路、炎癥信號通路、中樞神經系統等進行調節,在多種生理及病理過程中發揮重要作用。近 20 年來,脂肪因子越來越受到人們的關注,通過對脂肪因子的研究,人們逐漸對代謝的調節、肥胖、II 型糖尿病、炎癥的關系有了更深一步的認識。

CTRP 家族是目前脂肪因子研究領域中被廣泛關注的一類分子,包括脂聯素在內已有 16 個成員被發現,其中大部分成員均已有功能研究報道,脂聯素在肥胖,胰島素抵抗和由肥胖介導的慢性炎癥過程中的重要作用已經被確認。該家族主要特征是具有 N 端膠原樣結構域和 C 端 C1q 球狀結構域。CTRP4 是該家族中較為特殊的一個成員,它并不具有 N 端膠原樣結構域,同時,它是唯一一個具有兩個 C1q 結構域的成員。這一結構上的特殊性也提示我們,CTRP4 在該家族中或許有較為特殊的地位。

NF-κB 在細胞炎癥信號的誘發和調節中具有核心作用。在固有免疫系統識別病原模式分子后NF-κB 在巨噬細胞中的活化可以啟動下游一系列的炎癥級聯反應。NF-κB 可以對炎癥過程進行調控,研究已經證明肥胖與炎癥的關系非常密切。我們前期的研究表明 CTRP4 在 NF-κB 信號通路中可能具有重要的調節作用,因此對 CTRP4 進行深入研究對于闡釋炎癥、肥胖以及 NF-κB 信號通路都具有非常重要的意義。

本文共獲得了兩系 CTRP4 轉基因純合子小鼠,通過在 mRNA 和蛋白水平的鑒定,證明其在全身多種組織中均呈現高表達,表明轉基因鼠的構建是成功的。這為我們對 CTRP4 的體內功能和機制研究提供了有力的工具。