現代社會人們受到的應激因素增加,糖尿病、動脈粥樣硬化、血脂紊亂等代謝疾病發生率明顯升高。

流行病學研究發現,應激與代謝疾病的發生關系密切,但分子機制并不清楚。過氧化物酶體增殖物激活因子\\( peroxisome proliferator activated receptors,PPARs\\) 屬于細胞核甾體類受體超家族,根據結構和功能分為 PPARα、PPARβ/δ、PPARγ 三種亞型。近年的研究發現,PPARβ/δ 在調節脂質代謝、改善胰島素敏感性中發揮重要作用,有望成為高脂血癥、2型糖尿病治療新靶點。

肝臟是調節機體能量代謝的重要器官,三種PPARs 在肝臟均有不同程度的表達,其中 PPARβ / δ含量豐富,許多葡萄糖和脂肪酸代謝基因受PPARβ / δ 影響明顯。本研究以束縛應激大鼠為模型,觀察束縛應激對大鼠血 TG、血糖及肝臟中PPARβ / δ 表達的影響,初步探討應激時代謝異常發生的可能機制。

1 材料與方法

1. 1 材料 引物由北京賽百盛生物公司合成,DNAmarker 購自北京天根生化科技公司,RNA-Trizol 購自 Invitrogen 公司,RT-PCR 試劑盒購自大連 Takara公司,羊抗鼠 PPARβ/δ 一抗、羊抗鼠 GAPDH 一抗、HRP 兔抗羊二抗均購自 Santa Cruz 公司。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 動物分組及處理 健康雄性 Wistar 大鼠 32只,由軍事醫學科學院動物實驗中心提供\\( 合格證號為 SCXK-軍 2007-004\\) ,適應喂養 1 w 后,參考文獻[4-5]方法,按體重隨機分為 4 組: 正常對照組\\( C\\) 、束縛 1 w 組\\( R1\\) 、束縛 2 w 組\\( R2\\) 和束縛 4 w 組\\( R4\\) 。實驗周期為 4 w。對照組大鼠行抓取動作后放入飼養籠內,R4 組大鼠進行束縛應激 4 w; R2 組大鼠前 2 w 處理同對照組,第 3 w 開始接受束縛應激 2 w; R1 組前 3 w 處理同對照組,第 4 w 時進行應激 1 w。應激在 9: 00 ~ 12: 00 和 14: 00 ~ 17: 00 進行,期間所有大鼠均禁食、水。試驗結束后,大鼠麻醉后下腔靜脈取血,靜置離心取上清。用全自動生化分析儀測定大鼠血 TG、血糖水平; 血清皮質酮濃度采用放免法測定,血清去甲腎上腺素濃度采用酶聯免疫吸附測定,血清胰島素采用放免法測定,均嚴格按說明書進行。胰島素敏感指數\\( ISI\\) = In1/\\( 空腹血糖 × 空腹胰島素\\) 。迅速取出肝臟,置液氮中凍存備用。

1. 2. 2 PPARβ /δ mRNA 表達測定 參考文獻方法,迅速取出保存在液氮中的各組肝組織樣本,采用 Trizol 試劑一步法提取細胞總 RNA。嚴格按照RT-PCR 試劑盒說明書中的程序操作,先將各組RNA 逆轉錄為 cDNA,再配 PCR 反應體系擴增PPARβ / δ\\( 上游引物為 5'-ATCGGCCTGGCCTTCTAAAC-3',下游引物為 5 '-GTCTCTGTAGATCTCTTGC-3 ',擴增片段為239 bp\\) 、內參照物 GAPDH\\( 上游引物為5 '-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3 ',下 游 引 物 為 5 '-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3 ', 擴 增 片 段 為196 bp\\) ,按照擴增條件擴增 cDNA。將反應產物經2% 瓊脂糖凝膠\\( 含溴化乙錠 0. 5 mg / L\\) 電泳后,用GelDoc2000 凝膠圖像分析系統計算 PPARβ / δ 與GAPDH 的光密度值,各組肝組織 PPARβ / δ mRNA的相對表達量以兩者的比值\\( OD 值\\) 表示。

1. 2. 3 PPARβ /δ 蛋白表達測定 \\( Western blot\\)\\( 1\\) 提取肝臟組織總蛋白: 按照 100 mg 肝組織加入500 μl 的比例加入蛋白提取液,冰上充分研磨并靜置 30 min 后,12 000 r/min 離心 15 min。取上清液,按1∶4的比例加入上樣緩沖液后煮 5 min,于 -20 ℃冰箱備用。\\( 2\\) 電泳及轉移蛋白: 測定樣品蛋白含量后,各組樣品按照 20 μg 的上樣量,先進行聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳,繼之轉移蛋白至硝酸纖維素膜上。\\( 3\\) 免疫反應: 轉移完成后,5% 的脫脂奶粉封閉 1 h,一抗中 4 ℃過夜。用 TBST 洗膜后入二抗室溫下孵育 2 h,洗膜后暗室中超敏化學發光液顯影,X 線片壓片曝光,用 Image J 圖像分析軟件分析結果,各樣品的蛋白表達量以各目的條帶與內參照的灰度值和面積的乘積之比表示。

1. 3 統計學方法 結果以 x ± s 表示,所有數據均用 SPSS 12. 0 統計軟件包進行分析,組間比較采用單因素方差分析,P <0. 05 為差異有統計學意義。

2、 結果

2. 1 束縛應激對大鼠血清皮質醇、去甲腎上腺素、胰島素水平的影響 由表 1 可見,與 C 組大鼠相比,R1、R2、R4 組大鼠血清皮質酮、去甲腎上腺素、胰島素水平均升高\\( P <0. 05 或 P <0. 01\\) ; 但 R1、R2、R4組間血清皮質酮、去甲腎上腺素、胰島素無明顯差異\\( P >0. 05\\) 。

2. 2 束縛應激對大鼠血 TG、血糖和 ISI 的影響 由表 2 可見,與 C 組大鼠相比,R1、R2、R4 組大鼠血清TG 和血糖水平升高\\( P < 0. 01\\) ,ISI 明顯降低\\( P <0. 01\\) ; 但 R1、R2、R4 組間血清 TG、血糖和 ISI 無明顯差異\\( P >0. 05\\) 。

2. 3 束縛應激對大鼠肝臟 PPARβ /δ mRNA 表達的影響。由表 3 可見,與 C 組大鼠相比,R1、R2、R4 組大鼠肝臟中 PPARβ / δ mRNA 表達降低\\( P <0. 01\\) ,但 R1、R2、R4 組間肝臟中 PPARβ/δmRNA 表達無明顯差異\\( P > 0. 05\\) 。

2. 4 束縛應激對大鼠肝臟 PPARβ /δ 蛋白表達的影響。由表 4 可見,與 C 組大鼠相比,R1、R2、R4 組大鼠肝臟中 PPARβ / δ 蛋白表達降低\\( P <0. 05 或 P < 0. 01\\) ,但 R1、R2、R4 組間肝臟中PPARβ / δ 蛋白表達無明顯差異\\( P > 0. 05\\) 。

3、 討論

本研究發現,束縛應激大鼠皮質酮和去甲腎上腺素分泌增加,應激后神經內分泌的改變以交感神經興奮和下丘腦-垂體-腎上腺激活為特征,這是應激后的非特異性反應,提示應激模型制作成功。

應激后機體處于高代謝狀態,大腦中樞興奮、血液循環加快、心臟負荷加重。本研究發現,束縛應激大鼠血甘油三酯、血糖升高,ISI 降低。血糖、甘油三酯均是機體重要的能源物質,胰島素敏感性下降有利于節省能源物質,為大腦中樞、紅細胞等只能利用葡萄糖的器官和主要應激組織提供充足的能量供應。但是,長期循環中血糖和甘油三酯升高會對血管和組織器官造成損害,導致多種代謝性疾病的發生。

肝臟中 PPARβ/δ 含量豐富,包括脂質轉運、脂肪酸和葡萄糖氧化利用、戊糖磷酸途徑的多種基因受 PPARβ/δ 調控。本研究發現,束縛應激導致肝臟中 PPARβ/δ mRNA 和蛋白表達下降。肝臟中PPARβ / δ mRNA 和蛋白表達下降可能導致肝臟葡萄糖和脂肪酸利用減少,促進肝糖輸出和 TG、血糖升高。

束縛應激各組大鼠之間血 TG、血糖、ISI 水平無明顯差異,肝臟 PPARβ/δ mRNA 和蛋白表達也無明顯差異,提示束縛應激對大鼠血 TG、血糖和肝臟PPARβ / δ 表達的影響主要與束縛應激本身有關。