原標題:高氧液聯合缺血后處理對家兔腸缺血再灌注致肝損傷的保護作用

摘要:目的探討高氧液聯合缺血后處理對家兔腸缺血再灌注所致肝損傷的保護作用.方法將家兔48只隨機分為假手術組\\(SO組\\)、缺血再灌注組\\(IR組\\)、高氧液組\\(HO組\\)和高氧液缺血后處理組\\(HI組\\),每組12只.SO組家兔僅手術顯露腸系膜上動脈\\(SMA\\);IR組家兔阻斷SMA60min,再灌注120min;HO組家兔在阻斷SMA60min和再灌注120min過程中靜脈輸入高氧液;HI組家兔于阻斷SMA60min后,再灌注開始時靜脈輸入高氧液,同時進行3個循環的30s再灌注/30s阻斷的缺血后處理.再灌注120min后采集各組家兔動脈血、靜脈血及部分小腸、肝組織,檢測腫瘤壞死因子-α\\(TNF-α\\)、白細胞介素\\(IL\\)-10、丙氨酸氨基轉移酶\\(ALT\\)、天冬氨酸氨基轉移酶\\(AST\\)及內毒素水平,測定血清及小腸、肝組織內丙二醛\\(MDA\\)含量及髓過氧化物酶\\(MPO\\)、超氧化物歧化酶\\(SOD\\)活性,Chiu6級評分法觀察腸黏膜損傷情況,細菌培養觀察細菌移位率,免疫組織化學觀察肝組織中核因子κB\\(NF-κB\\)p65的表達.結果IR組家兔血清中TNF-α、IL-10、內毒素水平顯著高于SO組\\(P<0.01\\);HO組和HI組家兔血清中TNF-α、內毒素水平顯著低于IR組\\(P<0.05\\);HI組家兔血清中TNF-α、內毒素水平顯著低于HO組\\(P<0.05,P<0.01\\).HO組和HI組家兔血清中IL-10水平顯著高于IR組\\(P<0.01\\),HO組和HI組家兔血清中IL-10水平比較差異無統計學意義\\(P>0.05\\).IR組家兔血清中MPO活性和MDA水平顯著高于SO組\\(P<0.01\\),HO組和HI組家兔血清中MPO活性和MDA水平顯著低于IR組\\(P<0.01\\);HI組家兔血清中MPO活性和MDA水平顯著低于HO組\\(P<0.05,P<0.01\\).IR組家兔血清中SOD活性顯著低于SO組\\(P<0.01\\),HO組和HI組家兔血清中SOD活性顯著高于IR組\\(P<0.01\\),且HI組家兔血清中SOD活性顯著高于HO組\\(P<0.01\\).IR組、HO組和HI組家兔腸黏膜損傷評分顯著高于SO組\\(P<0.01\\),HO組和HI組家兔腸黏膜損傷評分顯著低于IR組\\(P<0.01\\),HI組家兔腸黏膜損傷評分顯著低于HO組\\(P<0.05\\).IR組家兔小腸黏膜組織中MPO活性和MDA水平顯著高于SO組\\(P<0.01\\);HO組和HI組家兔小腸黏膜組織中MPO活性和MDA水平顯著低于IR組\\(P<0.01\\);HI組家兔小腸黏膜組織中MPO活性和MDA水平顯著低于HO組\\(P<0.05\\).IR組家兔小腸黏膜組織中SOD活性顯著低于SO組\\(P<0.01\\);HO組、HI組血清SOD活性仍顯著高于IR組\\(P<0.01\\);HI組家兔小腸黏膜組織中SOD活性顯著高于HO組\\(P<0.05\\).SO組家兔肝組織均無細菌移位,IR組家兔肝臟細菌移位率100.0%,HO和HI組家兔肝臟細菌移位率均為83.3%,HO和HI組家兔肝臟細菌移位率與IR組比較差異均無統計學意義\\(P>0.05\\).IR組、HO組、HI組家兔肝組織內NF-κBp65陽性表達顯著高于SO組\\(P<0.01\\),HO組和HI組家兔肝組織內NF-κBp65陽性表達顯著低于IR組\\(P<0.01\\),HI組家兔肝組織內NF-κBp65陽性表達顯著低于HO組\\(P<0.05\\).IR組家兔肝組織中MPO活性及MDA、ALT、AST水平顯著高于SO組\\(P<0.01\\);HO組和HI組家兔肝組織中MPO活性及MDA、ALT、AST水平仍顯著低于IR組\\(P<0.01\\);HI組家兔肝組織中MPO活性及MDA、ALT、AST水平顯著低于HO組\\(P<0.05\\).IR組家兔肝組織中SOD活性顯著低于SO組\\(P<0.01\\),HO組和HI組家兔肝組織中SOD活性顯著高于IR組\\(P<0.01\\);HI組家兔肝組織中SOD活性顯著高于HO組\\(P<0.05\\).結論高氧液聯合缺血后處理可以減輕腸缺血再灌注引起的肝損傷.

關鍵詞:高氧液;缺血后處理;腸缺血再灌注損傷;肝損傷

腸缺血再灌注損傷\\( ischemical reperfusion inju-ry,IRI\\) 在嚴重感染、創傷、休克、心肺功能不全及小腸移植的病理演變過程中起重要作用[1],不僅可以引起腸黏膜上皮細胞吸收功能下降、腸黏膜屏障功能受損及腸道內正常菌群失調,引發全身炎癥反應綜合征,還可以造成肝損傷,具有較高的發病率和病死率[2],在這一過程中引起器官早期損害的直接首要因素是組織缺氧.高氧液是一種具有高氧分壓并含有治療劑量臭氧的醫用液體,可以通過物理方法改變氧的活性,使氧離子化,并在一定的壓力下溶解于水,再通過分子載體將氧直接帶入血液循環,增加組織氧儲備,提高機體的缺氧耐受能力,可以部分代償向組織細胞供氧,已應用于肝移植及缺血缺氧性腦病的研究[3].缺血后處理\\( ischemic post-condi-tioning,IP\\) 是指在長時間缺血的組織或器官再灌注起始即刻采取反復短暫的再灌注/停灌注,之后再恢復正常灌注,達到減輕組織或器官 IRI 的目的[4].有研究發現,不同的保護措施聯合應用對缺血器官的再灌注損傷可取得更好的治療效果[5-6].目前針對二者聯合應用對小腸 IRI 保護作用鮮有報道,本研究擬通過高氧液聯合 IP 干預家兔腸 IRI 模型,探討其對小腸及肝損傷的保護作用.

1 材料與方法

1. 1 實驗動物 健康家兔 48 只由新鄉醫學院實驗動物中心提供,雌雄不拘,體質量 2. 5 ~3. 7 kg,于新鄉醫學院實驗動物中心喂養,空氣濕度50. 0% ~55. 0% ,室溫 \\( 18. 0 ± 4. 0 \\) ℃ ,光照隨晝夜自然變化,標準飲食,自由飲水,術前禁食 12 h.實驗計劃通過新鄉醫學院第一附屬醫院倫理委員會批準,實驗過程符合《關于善待實驗動物的指導性意見》的規定.

1. 2 主要試劑及儀器 內毒素放射免疫試劑盒購自美國 Sigma 公司,腫瘤壞死因子-α\\( tumor necrosisfactor,TNF-α\\) 、白細胞介素-10\\( interleukin-10,IL-10\\)檢測試劑盒購自晶美生物工程有限公司,丙二醛\\( ma-londialdehyde,MDA\\) 、髓 過 氧 化 物 酶 \\( myeloperoxi-dase,MPO\\) 和超氧化物歧化酶\\( superoxide dismutase,SOD\\) 檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所,鏈霉親和素-生物素復合物\\( strept avidin-biotin complex,SABC\\) 免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司,兔抗大鼠核因子 κB\\( nuclear factorkappa B,NF-κB\\) p65 I 抗購自 Santa Cruz; GY-1 型高氧醫療液體治療儀購自西安高氧醫療設備有限公司.

1. 3 高氧液的制備 用醫用生理鹽水 500 mL 作為基液,將醫用氧通過 GY-1 型高氧醫療液體治療儀進行量子化處理,通過增加基液的凈水壓,去除基液中的氣核,提高其表面張力,使生理鹽水變成高氧液,應用血氣分析法測得溶氧前液體氧分壓為\\( 20. 2 ±0. 4\\) kPa,溶氧后氧分壓達到\\( 106. 2 ± 7. 8\\) kPa,整個配制過程根據機器的菜單提示完成操作.

1. 4 家兔腸缺血再灌注模型建立 稱家兔體質量,耳緣靜脈注射30 g·L- 1戊巴比妥鈉30 mg·kg- 1麻醉,仰臥固定\\( 背部交叉\\) .頸部正中切口,分離右頸總動脈,插管連接壓力傳感器,通過監護儀監測動脈壓.常規消毒后取腹部正中切口: 腹正中線自劍突下 2 cm 起向下作 6 cm 長切口,將腹腔內臟器左移,并齊右腎門垂直分離腹主動脈分出的腸系膜上動脈\\( superior mesenteric artery,SMA\\) ,在 SMA 根部用 1 個套硅膠管的小動脈夾鉗夾,觀察 2 min,待確定 SMA 血流己被阻斷,腸壁蒼白,血管無搏動后,縫合傷口,關閉腹腔.60 min 后重新開腹,打開動脈夾,恢復 SMA 血流供應,腸壁變紅,血管搏動良好,再次關閉腹腔; 為避免體液及熱量的喪失,再灌注2 h 后,重新開腹取標本.移動腹腔內臟器時動作要輕柔,不可過度牽拉損傷腸管,臟器不移出腹腔外,避免使用銳利器械分離 SMA,以免造成大出血而導致實驗失敗.

1. 5 實驗分組 48 只大鼠隨機分為 4 組,每組 12只.假手術組\\( SO 組\\) : 僅行開腹術,分離 SMA 不夾閉; 缺血再灌注組\\( IR 組\\) : 阻斷 SMA 60 min 造成小腸缺血,然后打開動脈夾恢復血流灌注,于再灌注120 min 結束實驗; 高氧液組\\( HO 組\\) : 在阻斷 SMA60 min 和再灌注120 min 過程中以20 mL·kg-1·min-1速度靜脈輸入高氧液,其余操作同 IR 組; 高氧液 IP組\\( HI 組\\) : 于夾閉 SMA 60 min 后,于再灌注開始時以 20 mL·kg- 1·min- 1速度靜脈輸入高氧液,同時進行 3 個循環的 30 s 再灌注/30 s 阻斷的 IP,總時間為 3 min,然后持續灌注 117 min 后結束實驗.

1. 6 標本采集 家兔在再灌注 2 h 后,在無菌操作下重新開腹,處死前抽取腹主動脈血和外周靜脈血各 5 mL; 另取 1 mL 門靜脈血,采用合成基質偶氮顯色法定量分析血液中細菌內毒素含量; 靜脈血低溫離心,分離血清,全自動生物化學分析儀檢測血清中丙氨酸氨基轉移酶\\( alanine aminotransferase,ALT\\) 、天冬氨酸氨基轉移酶 \\( aspartate aminotransferase,AST\\) 水平; 動脈血清中 TNF-α、IL-10 水平測定采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法,嚴格按照試劑盒說明書操作.無菌操作下切取部分小腸組織及肝組織,一部分于體積分數 4% 甲醛溶液中固定 48 h,經脫水透明、浸蠟、包埋后,切成4 μm 石蠟切片,蘇木精-伊紅\\( hematine eosin,HE\\) 染色; 腸黏膜損傷程度按Chiu 6 級評分法[7]分析.一部分肝組織用來檢測細菌移位; 另一部分小腸及肝組織用生理鹽水洗 3 次,清除殘血,用濾紙吸干,刮取腸黏膜組織及肝組織各0. 5 g,分別加入 40 ℃ 磷酸鹽緩沖溶液 5 mL,在冷水中用勻漿機勻漿,3 500 r·min- 1離心 1 min,取上清,-70 ℃ 冰箱保存.采用硫代戊巴比妥酸法測定血清和組織勻漿中 MDA 含量,黃嘌呤氧化酶還原法測定血清和組織勻漿中 SOD 活性,比色法測定血清和組織勻漿中 MPO 活性.

1. 7 免疫組織化學檢測肝組織內 NF-κB p65 表達按照 SABC 試劑盒說明書操作,取石蠟切片常規脫蠟至水,體積分數 3% H2O2滅活內源性過氧化氫酶,高壓抗原修復,山羊血清封閉,滴加 1: 100 比例稀釋的兔抗大鼠 NF-κB p65 一抗,4 ℃過夜后滴加山羊抗兔二抗,滴加 SABC 復合物,二氨基聯苯胺顯色,蒸餾水洗滌終止顯色,蘇木精復染、脫水、透明、封片,以磷酸鹽緩沖液代替 I 抗孵育作為陰性對照.

高倍鏡下細胞質內呈棕黃色或黃色的顆?；驁F塊為陽性細胞,觀察片中 10 個具有代表性的高倍鏡視野,計算 1 000 個肝細胞中染色陽性細胞數除以1 000 作為 NF-κB p65 表達陽性指數 \\( positive in-dex,PI\\) ,并用數碼相機成像.

1. 8 統計學處理 應用 SPSS 19. 0 統計軟件進行分析,計量資料以均數 ± 標準差\\( x ± s\\) 表示,多組間比較采用完全隨機設計的單因素方差分析,兩兩比較采用 LSD 法,P <0. 05 為差異有統計學意義.

2 結果

2. 1 各組家兔血清中 TNF-α、IL-10、內毒素、MDA水平及 MPO、SOD 活性的變化 結果見表1.再灌注 2 h 后,IR 組家兔血清中 TNF-α、IL-10、內毒素水平顯著高于 SO 組,差異有統計學意義\\( P < 0. 01\\) ;HO 組和 HI 組家兔血清中 TNF-α、內毒素水平顯著高于 SO 組,但顯著低于 IR 組,差異有統計學意義\\( P < 0. 05,P < 0. 01\\) ; HI 組家兔血清中 TNF-α、內毒素水平顯著低于 HO 組,差異有統計學意義\\( P <0. 05,P < 0. 01\\) .HO 組和 HI 組家兔血清中 IL-10水平顯著高于 IR 組,差異有統計學意義 \\( P <0. 01\\) ; HO 組和 HI 組家兔血清中 IL-10 水平比較差異無統計學意義\\( P > 0. 05\\) .IR 組家兔血清中MPO 活性和 MDA 水平顯著高于 SO 組,差異有統計學意義\\( P <0. 01\\) ; HO 組和 HI 組家兔血清中 MPO活性和 MDA 水平顯著高于 SO 組,但顯著低于 IR組,差異均有統計學意義\\( P < 0. 01\\) ; HI 組家兔血清中 MPO 活性和 MDA 水平顯著低于 HO 組,差異有統計學意義\\( P < 0. 05,P < 0. 01\\) .IR 組、HO 組和 HI 組家兔血清中 SOD 活性顯著低于 SO 組\\( P <0. 01\\) ,但 HO 組和 HI 組家兔血清中 SOD 活性均顯著高于 IR 組\\( P < 0. 01\\) ,且 HI 組家兔血清中 SOD活性顯著高于 HO 組\\( P <0. 01\\) .

2. 2 小腸黏膜病理改變及其 MDA 水平和 MPO、SOD 活性變化 光鏡下 SO 組家兔小腸黏膜絨毛完整,無明顯上皮下間隙擴張; IR 組家兔小腸黏膜可見絨毛破損,上皮細胞水腫明顯,部分壞死脫落,固有層紅細胞增多,少部分腸黏膜固有層破壞和潰瘍;HO 組和 HI 組小腸黏膜絨毛損傷程度較 IR 組減輕,HI 組損傷程度較 HO 組輕; 見圖 1.IR 組、HO組和 HI 組家兔腸黏膜損傷評分顯著高于 SO 組\\( P <0. 01\\) ,HO 組和 HI 組家兔腸黏膜損傷評分顯著低于 IR 組\\( P < 0. 01\\) ; HI 組家兔腸黏膜損傷評分顯著低于 HO 組\\( P <0. 05\\) .IR 組家兔小腸黏膜組織中 MPO 活性和 MDA 水平顯著高于 SO 組\\( P <0. 01\\) ; HO 組和 HI 組家兔小腸黏膜組織中 MPO 活性和 MDA 水平顯著高于 SO 組\\( P < 0. 01\\) ,但顯著低于 IR 組\\( P < 0. 01\\) ; HI 組家兔小腸黏膜組織中MPO 活性和 MDA 水平顯著低于 HO 組\\( P < 0. 05\\) .IR 組、HO 組和 HI 組家兔小腸黏膜組織中 SOD 活性顯著低于 SO 組\\( P < 0. 01\\) ; HO 組、HI 組家兔血清 SOD 活性均顯著高于 IR 組\\( P < 0. 01\\) ; HI 組家兔小腸黏膜組織中 SOD 活性顯著高于 HO 組\\( P <0. 05\\) ; 見表 2.

2. 3 各組家兔肝臟病理學改變及肝組織內 NF-κBp65 表達、MDA 水平及 MPO 和 SOD 活性的變化光鏡下 SO 組家兔肝小葉結構完整,肝板排列整齊,血管內皮細胞無脫落,肝竇間隙正常,內皮細胞無脫落,肝細胞無變性壞死; IR 組家兔肝小葉結構不完整,肝板排列紊亂,肝細胞有不同程度的變性,胞核濃縮、深染,可見脫落的內皮細胞,伴有肝細胞點狀壞死; HO 組和 HI 組家兔肝組織病理改變較 IR組輕,肝小葉結構尚完整,肝板排列比較整齊,偶見內皮細胞脫落,肝細胞變形壞死少見; 見圖 2.無菌操作下分別切取肝組織進行細菌培養,發現 SO 組家兔肝組織均無細菌移位,IR 組家兔肝臟細菌移位率 100. 0%,HO 和 HI 組家兔肝臟細菌移位率均為83. 3% ,HO 和 HI 組家兔肝臟細菌移位率與 IR 組比較差異均無統計學意義\\( P >0. 05\\) .細菌培養結果顯示主要細菌為大腸桿菌、腸球菌、葡萄球菌,與小腸內細菌相同.IR 組、HO 組、HI 組家兔肝組織內 NF-κB p65 陽性表達顯著高于 SO 組\\( P <0. 01\\) ,HO 組和 HI 組家兔肝組織內 NF-κB p65 陽性表達顯著低于 IR 組\\( P <0. 01\\) ,HI 組家兔肝組織內 NF-κB p65 陽性表達顯著低于 HO 組\\( P < 0. 05\\) ; 見圖 3和表 3.再灌注 2 h 后,IR 組家兔肝組織中 MPO 活性及 MDA、ALT、AST 水平顯著高于 SO 組\\( P <0. 01\\) ; HO 組和 HI 組家兔肝組織中 MPO 活性及MDA、ALT、AST 水平仍顯著高于 SO 組\\( P < 0. 01\\) ,但顯著低于 IR 組\\( P < 0. 01\\) ; HI 組家兔肝組織中MPO 活性及 MDA、ALT、AST 水平顯著低于 HO 組\\( P <0. 05\\) .IR 組家兔肝組織中 SOD 活性顯著低于 SO 組\\( P < 0. 01\\) ,HO 組和 HI 組家兔肝組織中SOD 活性仍低于 SO 組,但顯著高于 IR 組 \\( P <0. 01\\) ; HI 組家兔肝組織中 SOD 活性顯著高于 HO組\\( P <0. 05\\) ; 見表 3.

3 討論

高氧液可以不依賴于肺的氣體交換功能,通過血液循環系統直接向組織供氧,迅速改善動脈血氧分壓、組織氧分壓以及細胞有氧代謝水平[8],持續灌注高氧液及高氧液預處理均可減輕心臟、肺臟的IRI.由于上述應用高氧液的方式只能在缺血之前進行,而臨床中缺血的時機常不可預知,所以高氧液預處理與持續灌注的應用價值受到很大限制.IP是一種機械性干預措施,可以在缺血后施行,可操作性大,目前 IP 對心臟[9]、肝臟[10]IRI 的保護作用已取得進展,有研究發現 IP 與抗氧化劑聯合對臟器IRI 的保護作用可能更強[11].MDA 是氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸引發過氧化作用形成的脂質過氧化物,可間接反映細胞損傷程度[12],MPO 是中性粒細胞胞質中的一種特異性酶,血清及組織中 MPO 活性可間接反映中性粒細胞浸潤和激活的程度[13].SOD 是氧自由基清除劑,其活性降低可反映氧自由基的增多和細胞損傷的加重.本研究發現,腸 IRI 2 h 后,IR 組家兔血清和小腸、肝組織中 MDA 水平和 MPO 活性均比 SO 組顯著升高,SOD 活性較 SO 組顯著降低;表明 IRI 后小腸及肝組織脂質過氧化反應增強,中性粒細胞浸潤增加,自身清除氧自由基能力減弱,引起組織及血液中氧自由基升高,抗氧化能力下降,加重組織損傷.本研究發現,HO 組和 HI 組家兔血清及小腸、肝組織 MDA 水平和 MPO 活性較 IR 組明顯下降,SOD 活性較 IR 組明顯升高,提示靜脈應用高氧液和高氧液聯合 IP 均能夠提升小腸及肝臟的氧自由基的清除能力,減輕中性粒細胞浸潤,啟動了細胞內源性保護機制,進而提高抗氧化能力,減輕組織損傷,其中高氧液 IP 的清除自由基和抗氧化能力更強,其可能的機制是通過多次反復灌注/缺血使缺血的臟器血流恢復,減少了氧自由基底物,增加了組織的供氧,減少了氧自由基的生成,減輕臟器的損傷.

本實驗還發現,再灌注 2 h 后,腸黏膜屏障受到損害,導致腸道細菌、內毒素移位,腸源性細菌及內毒素持續侵入門靜脈以及腸源性炎性介質釋放入血,激活炎性細胞,使肝臟受損,ALT、AST 水平急劇升高.肝細胞損傷進一步激活 Kupffer 細胞、中性粒細胞釋放大量促炎因子和炎性介質,激活 NF-κB 信號通路,而活化的 NF-κB 可上調前炎性細胞因子TNF-α 的基因轉錄[14].TNF-α 是由激活的巨噬細胞、內皮細胞、中性粒細胞等分泌的具有多功能的多肽,在炎癥反應過程中起著十分重要的作用[15].

TNF-α 可以誘導氧自由基產生,促進中性粒細胞產生氧自由基等活性氧遞質并導致肝損傷[16].IL-10是由輔助性 T 淋巴細胞分泌的細胞因子,作為體內炎癥反應過程中的內生性抗炎細胞因子,抑制 TNF-α,IL-1β 等多種炎癥相關因子的產生[17].從炎性因子指標的變化及 NF-κB p65 的陽性表達變化方面推斷,發生腸 IRI 后,血液中內毒素增加,抗氧化能力下降,氧自由基的清除能力下降,釋放大量促炎因子和脂質炎性介質,激活 NF-κB 信號通路,上調TNF-α 水平,引起肝損傷.單獨應用高氧液及高氧液聯合 IP 均可以減少內毒素的釋放,增強抗氧化能力,減少促炎因子和脂質炎性介質的釋放,降低 NF-ΚB p65 的表達,抑制 NF-κB 信號通路調控的炎癥級聯反應,減輕肝損傷,但高氧液聯合 IP 的保護作用明顯優于單獨應用高氧液.

綜上所述,高氧液是一種高效抗氧化劑,單獨應用高氧液和高氧液聯合 IP 均可以減輕腸黏膜損傷,減少內毒素移位,減少氧自由基的生成,促進抗炎因子的激活,抑制 NF-κB 信號通路調控的炎癥級聯反應,減輕肝損傷.但高氧液聯合 IP 的保護效果優于單獨應用高氧液,其聯合應用的保護機制仍需進一步研究,但高氧液聯合 IP 可以為臨床外科防治腸 IRI 所導致的多器官損傷治療及預防提供新策略.

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