已有研究[1]顯示,心肌梗死的發生與炎癥反應相關.炎癥反應是組織能夠愈合的條件,但同時也能引起組織的進一步損傷,影響心室重塑,導致心肌梗死和心肌功能的下降[2].越來越多的證據表明,心肌組織損傷反應與先天免疫系統相關,包括多種受體家族.

目前研究較多的是 Toll 樣受體家族,它能夠識別微生物來源的保守序列.NLP 家族 pyrin 結構域 3 \\( NLRP3\\) 是細胞質識別受體,通過形成復合體調節先天免疫反應和炎癥.NLRP3 炎癥體是多蛋白復合體,它能夠活化炎癥細胞因子白介素 1β\\( IL-1β\\) 和白介素 18\\( IL-18\\) 的前體.

活化的 NLRP3 炎癥體也能夠誘導細胞死亡[3].我們對心肌缺血缺氧狀態下 NLRP3 在心肌成纖維細胞中的表達作一觀察,為心肌梗死及心肌缺血的診斷和治療提供分子理論研究基礎.

1 材料與方法

1. 1 實驗動物及主要試劑

Wistar 大鼠購自中國醫科大學實驗動物部,抗NLRP3 抗體和氯化鈷購于 Sigma 公司,Trizol 試劑和引物合成購于 Invitrogen 公司,逆轉錄和 Real-time PCR 試劑盒購于 TaKaRa 公司,二抗購于北京中杉金橋生物技術有限公司,DMEM 培養基和血清購于 Hyclone 公司.

1. 2 大鼠心肌成纖維細胞的體外培養

予5%異氟醚氣體將 Wistar 大鼠麻醉,摘除心臟,用無鈣離子的 Tyrode 氏液逆行灌注,Ⅱ型膠原酶酶解心肌細胞.分離大鼠的心肌成纖維細胞,進行體外培養.

1. 3 大鼠心肌成纖維細胞缺氧誘導

將體外培養的原代大鼠心肌成纖維細胞分成兩組: 實驗組加入 100 μmol·L- 1氯化鈷或在 5% 低氧孵箱中培養,模擬缺氧的細胞生存環境; 對照組采用普通培養基培養.24 h 后收集細胞.5% 低氧孵箱是充入氮氣的細胞培養孵箱,能夠將氧氣含量控制在 5%,對細胞進行低氧培養.

1. 4 總 RNA 提取和反轉錄

收集兩組大鼠心肌成纖維細胞,用 Trizol 提取總RNA,操作步驟按照 Invitrogen 公司 Trizol 說明書進行.紫外分光光度計測定 RNA 純度并定量.取 500 ng 的總RNA 進行反轉錄,合成 cDNA,操作步驟按照 TaKaRa公司反轉錄說明書進行.

1. 5 實時定量 PCR 檢測 NLRP3 表達

利用安捷倫 Mx3000PTMReal-time PCR 系統進行擴增,操作步驟按照 TaKaRa 公司 SYBR Green I 試劑盒進行操作.以實驗組和對照組的 cDNA 為模版,擴增引物為 NLRP3F: 5'-GAG TTC TTC GCT GCT ATG T-3'; NLRP3R: 5'- ACC TTC ACG TCT CGG TTC-3';ActinF: 5'-TCA CCA ACT GGG ACG ACA-3'; ActinR:5'-ACA GCA CCG CCT GGA TAG-3'.實驗重復 3 次,每次進行 3 復孔檢測.

1. 6 Western blot 檢測 NLRP3 表達

實驗組和對照組心肌成纖維細胞中加入 100 μl含有蛋白酶抑制劑的 RIPA 裂解液,冰上孵育裂解細胞,低溫下 13 000 × g 離心 15 min.取上清進行蛋白定量.經 10% SDS-PAGE 凝膠分離,恒壓轉移至PVDF 膜上.將 PVD 下膜用 anti-NLRP3 抗體\\( 1 ∶ 500稀釋\\) 進行在4 ℃條件孵育過夜.再用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔\\( 1∶ 5 000 稀釋\\) 二抗常溫孵育 2 h.ECL 發光顯影.將膜 stripping 后,重新封閉,加入內參β-actin 抗體\\( 1∶ 6 000,北京中杉金橋生物技術有限公司\\) 作為對照[4].本實驗重復 2 次.

2 結 果

2. 1 NLRP3 基因表達水平

經過 Real-time PCR 檢測發現,在氯化鈷和低氧培養的實驗組中 NLRP3 基因表達明顯高于對照組.見圖1.

2. 2 NLRP3 蛋白質表達水平

Western blot 實驗檢測在氯化鈷和低氧培養的實驗組中,NLRP3 蛋白質表達明顯高于對照組.見圖 2.

3 討 論

NLRP3 基因定位于 1 號染色體長臂上,是由 pyrin樣蛋白所編碼,包括 pyrin 樣結構域、核苷酸結合結構域及亮氨酸富含重復基序.它能與含有 pyrin 結構域的凋亡相關斑點樣蛋白 CARD 結合[5],CARD 蛋白與炎癥和免疫反應相關.NLRP3 蛋白可能是 NF-κB 信號通路的活化因子[6].

NLRP3 炎癥小體是多蛋白復合體,NLRP3 能夠通過活化細胞因子白介素前體引起促炎因子過度表達,導致慢性炎癥和自身免疫疾病.NLRP3 能夠被很多刺激因素激活,包括細菌、病毒、真菌、死細胞復合物及晶體顆粒等.炎癥小體的活化對于病源清除和免疫應答誘導起著重要作用[7],而 NLRP3 炎癥小體活性失調能夠引起多種疾病的發生,包括冷吡啉相關周期性綜合征、痛風、Ⅱ型糖尿病、克羅恩病、動脈粥樣硬化等[8].NLRP3 炎性體促進炎癥的有害作用和活性失調引起疾病的發生將是我們研究的重點.

在缺血狀態下,心肌細胞氧含量迅速下降,可引起心肌缺血,局部組織細胞發生死亡.本研究利用氯化鈷和低氧細胞培養箱體外培養大鼠的心肌成纖維細胞,模擬心肌缺氧微環境,利用實時定量 PCR 和Western blot 實驗檢測,結果發現 NLRP3 基因在實驗組中的表達明顯高于對照組.實驗結果提示,在心肌缺氧狀態下,NLRP3 可能作為重要的信號分子參與了心肌損傷的過程.

綜上所述,當心肌細胞發生缺氧時,NLRP3 表達增高,引起一系列的免疫應答反應,導致心肌細胞的進一步嚴重損傷.通過本課題研究,我們初步認為,NLRP3 可能成為早期診斷心肌缺血缺氧的重要分子靶點,也為心肌缺血后的免疫應答機制提供了一定的分子理論基礎.

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