近年來,隨著基因敲除及轉基因技術的興起及發展,小鼠作為實驗動物在心血管疾病的研究中發揮越來越重要的作用. 主動脈弓縮窄術\\(transverseaortic constriction,TAC\\)是目前常用的研究壓力過負荷型心肌肥大及心力衰竭的模型[1]. TAC 所致的病理性心肌肥大不是一個靜止狀態,而是一個進行性發生發展的過程. 心臟在受到過度的壓力負荷時會發生代償性心肌肥大\\(向心性肥大\\),此時如無有效的干預措施,代償性心肌肥大會進展為失代償性心肌肥大\\(離心性肥大\\),甚至心力衰竭[2]. 小鼠TAC 后發生心肌肥大的時間及嚴重程度主要與主動脈弓縮窄程度直接相關. 結合國內外的報道,目前 TAC 時采用的縮窄針主要有 26G 及 27G 兩種型號[3-4],但是由于小鼠的個體差異以及人為操作的不同,即使采用相同的縮窄針也可能造成不一致的縮窄程度.
因此,建立客觀評價小鼠主動脈弓縮窄程度的方法便成為影響整個實驗成敗的前提及基礎. 本研究采用超聲多普勒檢測方法,通過頸右動脈與頸左動脈血流之比來評價 TAC 的成敗及程度,并在術后 2 周對主動脈弓不同縮窄程度的小鼠進行超聲心動圖及心臟形態學觀察,了解主動脈弓縮窄程度與心肌肥大發生發展的相關性,為 TAC 在心血管疾病研究中的應用奠定基礎.
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物及分組
6~8 周清潔級雄性 C57BL / 6 小鼠 60 只, 體重22~25 g, 由北京大學醫學部提供 [生產許可證號SCXK\\(京\\)2011-0012]. 于 12 h 明暗交替,室溫 18~23℃動物房飼養. 小鼠隨機分為 3 組,分別為假手術組\\(sham\\)、26G 縮窄針主動脈弓縮窄組 \\(TAC26G組\\)27G 縮窄針主動脈弓縮窄組 \\(TAC27G組\\),每組 20 只.
1.1.2 主要儀器
ALC-V8S 型小動物呼吸機\\(上海奧爾科特生物技術有限公司\\),ALC-HTP 型動物恒溫系統\\(上海奧爾科特生物技術有限公司\\),LG-PS2 鵝頸冷光源\\(Olympus 公司,日本\\),顯微手術器械 \\(上海醫療器械有限公司\\),AE-100 電子分析天平 \\(Mettler 公司,瑞士\\),VEVO 2100 超聲儀\\(Visual Sonics 公司,加拿大\\).
1.2 方法
1.2.1 主動脈弓縮窄小鼠模型建立.
按照已有文獻報道進行模型建立[5-6],采用氯胺酮\\(80 mg/kg\\)與甲苯噻嗪\\(15 mg/kg\\)混合,腹腔注射麻醉,小鼠麻醉后仰臥位固定于恒溫墊上,經氣管插管與小動物呼吸機連接\\(潮氣量 0.5 ml/ 次,呼吸頻率 105~110 次 /min\\). 于胸骨前正中打開胸腔,暴露主動脈弓部,在左頸總動脈與頭臂干之間穿一 5-0 號絲線, 并緊貼血管上置一 26G 或 27G 縮窄針,用絲線將動脈與針頭一起扎緊并迅速抽出針頭,按照統一標準造成不完全縮窄,常規關胸,縫皮. 手術切口處用碘伏涂覆,待小鼠自主呼吸恢復后脫機.假手術組除不做縮窄外, 其余操作均與主動脈弓縮窄組相同.
1.2.2 超聲多普勒檢測小鼠頸總動脈流速
應用 VEVO 2100 超聲儀及 40 MHz 高頻探頭對小鼠進行超聲多普勒檢測, 獲取血液流速的二維及彩色圖像. 根據右側頸動脈流速與左側頸動脈流速之比來判斷小鼠 TAC 的成敗及手術的一致性. 頸右動脈 / 頸右動脈 \\(RCA/LCA\\) 為 5~7 者入 TAC26G組,RCA/LCA 為 8~10 者入 TAC27G組.
1.2.3 超聲心動圖檢測小鼠心臟結構及功能
應用 VEVO 2100 超聲儀及 40 MHz 高頻探頭于術后 2 周對小鼠進行超聲心動圖檢測,獲得 M 型超聲心動圖圖像,檢測舒張期室間隔厚度\\(IVSd\\);舒張期左心室后壁厚度\\(LVPWd\\);左心室舒張期室內徑\\(LVIDd\\);射血分數\\(EF\\)及短軸縮短率\\(FS\\).所有操作均由超聲醫師采用雙盲法進行. 所有檢測均取6 個不同心動周期的平均值.
1.2.4 標本收集與處理
術后 2 周將小鼠麻醉后固定,稱重,取其心臟組織,拍照后按照統一標準修剪非心臟組織,稱重,計算心臟重量 / 體重\\(HW/BW\\). 修剪去左右心房及右心室, 稱量左心室重量, 計算左心重量 / 脛骨長度\\(LVW / TL\\).
1.3 統計學方法
應用 GraphPad Prism 5 統計軟件包進行數據處理,計量數據用均數 ± 標準誤\\(x ± sx\\)表示. 單因素方差分析進行組間變異度分析, 兩兩比較采用Tukey 檢驗. P≤0.05 為差異具有統計學意義.
2 結 果
2.1 超聲多普勒對小鼠主動脈弓縮窄程度的評價與比餃.
主動脈弓縮窄術后 6 h, 分別對各組小鼠行超聲多普勒檢測右側及左側頸動脈流速. 結果顯示,RCA / LCA sham 組 1.037 ± 0.113,TAC26G組 5.365 ±0.587,TAC27G組 8.545 ± 0.601,3 組比較差異有統計學意義\\(F = 356.1,P < 0.001\\). 與 sham 組\\(n = 20\\)比較,TAC26G組\\(n = 18\\)及 TAC27G組\\(n = 16\\)RCA/LCA 均 顯 著 增 加 , 差 異 具 有 統 計 學 意 義 \\(P <0.001\\);TAC27G組 RCA/LCA 較之 TAC26G組差異也具有統計學意義\\(P < 0.001,圖 1\\).
2.2 超聲心動圖對小鼠心臟結構及功能的評價與比較
主動脈弓縮窄手術后 2 周,采用超聲心動圖對各組小鼠心臟結構及功能進行檢測. 結果顯示,各指標 3 組比較差異均有統計學意義\\(IVSd:F = 22.09,P < 0.01;LVPWd:F = 18.01,P < 0.01;LVIDd:F =34.68,P < 0.01;EF:F = 55.04,P < 0.01;FS:F =20.47,P < 0.01\\). 與 sham 組\\(n = 20\\)比較,TAC26G組\\(n = 18\\)及 TAC27G組\\(n = 16\\)IVSd 及 LVPWd 均顯著增加, 差異具有統計學意義 \\(P < 0.001, 圖 2A~C\\); 與 sham 組相比,TAC26G組 LVIDd 明顯減小,而TAC27G組 LVIDd 則明顯增加,差異具有統計學意義\\(圖 2A、D\\); 與 sham 組相比,TAC26G組 EF 及 FS 均顯著增加,而 TAC27G組 EF 及 FS 均顯著下降,差異具有統計學意義\\(圖 2E、F\\).
結果提示,采用 26G 縮窄針行小鼠主動脈弓縮窄術,小鼠 RCA/LCA 為 5~7,術后 2 周,小鼠室間隔及左室后壁增厚,左心腔縮小,收縮功能增強,發生了典型的向心性肥大;采用 27G 縮窄針行小鼠主動脈弓縮窄術,小鼠 RCA/LCA 為 8~10,術后 2 周,小鼠室間隔及左室后壁較之 TAC26G組有所下降,左心腔顯著擴大,收縮功能下降,發生了典型的離心性肥大.
2.3 各組小鼠 HW / BW 及 LVW / TL 的比較
結果顯示,HW/BW 及 LVW/TL 3 組比較差異均有統計學意義\\(F = 54.93,P < 0.01;F = 59.84,P <0.01\\). 與 sham 組相比,TAC26G組及 TAC27G組均發生明顯的心肌肥大\\(圖 3A\\),HW/BW 及 LVW/TL 均顯著增加,差異具有統計學意義\\(P < 0.001\\);TAC27G組較之 TAC26G組其 HW/BW 及 LVW/TL 明顯增加,差異也具有統計學意義\\(圖 3B、C\\).
3 討 論
病理性心肌肥大所致的心力衰竭是目前心血管疾病致死的主要因素之一[7-8]. 研究病理性心肌肥大的發生發展機制, 尋找治療及延緩心力衰竭發展進程的生物學靶點是目前心血管疾病研究的首要目標. 壓力過負荷所引起的病理性心肌肥大是一個從代償逐漸進展為失代償最終導致心力衰竭及死亡的連續性過程[2]. 不同階段的病理性心肌肥大,其治療及預防亦不盡相同. 因此,不同疾病階段相應動物模型的建立對于病理性心肌肥大的研究具有十分重要的指導作用.
小鼠主動脈弓縮窄致壓力后負荷增加所引起的病理性心肌肥大是目前最常見的研究心肌肥大及心力衰竭的動物模型[9]. 造模是否成功對整個實驗的成敗具有至關重要的作用,而影響造模成敗的關鍵因素則是 TAC 的縮窄程度. 小鼠的主動脈主要有 3個分支,分別為右頭臂動脈、左頸總動脈及左鎖骨下動脈[10]. TAC 是指在右頭臂動脈與左頸總動脈之間進行一定程度的縮窄,使左心室后負荷增加,從而復制病理性心肌肥大模型. TAC 一旦成功,右頭臂動脈即可部分分流血液, 而左頸總動脈的血流則相應降低.因此,通過計算右側頸總動脈血流與左側頸總動脈血流之比即可反映 TAC 的成敗及程度. 本實驗根據小鼠的解剖特征, 采用超聲多普勒的方法對小鼠 TAC 的縮窄程度進行量化、客觀的評估,在實驗初期即可準確判斷手術的成模率及一致性. sham 組沒有進行任何程度的縮窄, 其右側頸動脈流速與左側基本相同;26G 縮窄針一般認為可以造成中度程度的縮窄, 其右側頸動脈流速與左側之比為 5~7;27G縮窄針一般認為可以造成重度程度的縮窄,其右側頸動脈流速與左側之比為 8~10. 我們的研究結果為中度縮窄及重度縮窄提供了可靠的量化指標,避免了小鼠個體差異及人為操作造成的造模失敗.
TAC 的縮窄程度與心肌肥大的嚴重程度及肥大出現的時間窗密切相關[11-12]. 縮窄度高則肥大出現的時間早并且進展至失代償期所用的時間短,縮窄度低則肥大出現的時間晚并且代償期維持的時間長. 已有研究報道,重度 TAC 2 周即可導致小鼠發生心力衰竭,而輕度 TAC 則需 8 周方可引起小鼠心功能下降[3,13]. 本研究分別采用 26G、27G 縮窄針對小鼠主動脈弓進行中度、重度縮窄,術后 2 周對小鼠行超聲心動圖檢測,結果顯示中度縮窄的小鼠發生典型的向心性肥大,重度縮窄的小鼠發生典型的離心性肥大. 心臟重量 / 體重及左心重量 / 脛骨長度是衡量心肌肥大的經典指標[14-15],小鼠解剖稱重發現,與 sham 組相比,TAC26G組及 TAC27G組心臟重量 / 體重及左心重量 / 脛骨長度均明顯增加,TAC27G組上述兩個肥大指標較之 TAC26G組增加更為明顯. 以上結果表明,病理性心肌肥大的發展階段依賴于心臟承受的負荷,同時也為心肌肥大及心力衰竭相關研究如何選擇縮窄程度提供一定的依據.
本研究建立了客觀、準確評價小鼠主動脈弓不同程度縮窄模型的方法,在實驗初期即可排除手術造成的組內差異對結果的影響,并研究了不同程度的縮窄度與心肌肥大所處階段的相關性,對壓力超負荷心肌肥大及心力衰竭相關研究動物模型的選擇具有重要的指導作用.
[參考文獻]
[1] Tarnavski O,McMullen JR,Schinke M,et al. Mouse car-diac surgery:comprehensive techniques for the generationof mouse models of human diseases and their applicationfor genomic studies [J]. Physiol Genomics,2004,16 \\(3\\):349-360
[2] Diwan A,Dorn GN. Decompensation of cardiac hypertro-phy:cellular mechanisms and novel therapeutic targets[J]. Physiology \\(Bethesda\\),2007,22\\(1\\):56-64
[3] 李曉梅,馬依彤,楊毅寧,等. 小鼠主動脈弓縮窄模型的建立及評價[J]. 中國比較醫學雜志,2008,18\\(11\\);24-29
[4] Zelarayan L,Renger A,Noack C,et al. NF-kappaB acti-vation is required for adaptive cardiac hypertrophy [J].Cardiovasc Res,2009,84\\(3\\):416-424
[5] Chintalgattu V,Ai D,Langley RR,et al. CardiomyocytePDGFR-beta signaling is an essential component of themouse cardiac response to load-induced stress [J]. J ClinInvest,2010,120\\(2\\):472-484
[6] Patten RD,Pourati I,Aronovitz MJ,et al. 17 Beta-estradi-ol differentially affects left ventricular and cardiomyocytehypertrophy following myocardial infarction and pressureoverload[J]. J Card Fail,2008,14\\(3\\):245-253
[7] Gary R,Davis L. Diastolic heart failure [J]. Heart Lung,2008,37\\(6\\):405-416
[8] MacIver DH. Is remodeling the dominant compensatorymechanism in both chronic heart failure with preservedand reduced left ventricular ejection fraction? [J]. BasicRes Cardiol,2010,105\\(2\\):227-234
[9] Li Y,Ha T,Gao X,et al. NF-kappaB activation is re-quired for the development of cardiac hypertrophy in vivo[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2004,287 \\(4\\);H1712-H1720
[10] DeAlmeida AC,van Oort RJ,Wehrens XH. Transverseaortic constriction in mice[J]. J Vis Exp,2010\\(38\\):1729[11] Liao Y,Ishikura F,Beppu S,et al. Echocardiographic as-sessment of LV hypertrophy and function in aortic-band-ed mice:necropsy validation[J]. Am J Physiol Heart CircPhysiol,2002,282\\(5\\);H1703-H1708
[12] Zhu Y,Li T,Song J,et al. The TIR / BB-loop mimetic AS-1 prevents cardiac hypertrophy by inhibiting IL-1R-medi-ated MyD88-dependent signaling [J]. Basic Res Cardiol,2011,106\\(5\\):787-799
[13] Toischer K,Rokita AG,Unsold B,et al. Differential cardiacremodeling in preload versus afterload [J]. Circulation,2010,122\\(10\\):993-1003
[14] Chen J,Shearer GC,Chen Q,et al. Omega-3 fatty acidsprevent pressure overload-induced cardiac fibrosisthrough activation of cyclic GMP / protein kinase G sig-naling in cardiac fibroblasts [J]. Circulation,2011,123\\(6\\):584-593
[15] Grote-Wessels S,Baba HA,Boknik P,et al. Inhibition ofprotein phosphatase 1 by inhibitor-2 exacerbates progres-sion of cardiac failure in a model with pressure overload[J]. Cardiovasc Res,2008,79\\(3\\):464-471
