近年來研究發現動脈粥樣硬化和高血壓的發生與血管炎癥反應存在著緊密聯系，動脈內膜出現脂質斑點、粥樣或纖維樣斑塊等炎性病變，使血管壁增厚和血管內皮細胞受損造成血管硬化和血管阻力增高是高血壓發生、發展的重要原因。許多炎癥因子可以通過直接作用于血管內皮細胞，導致其功能紊亂和血管張力失調，從而參與高血壓發生和發展的病理過程。內皮細胞內貯存著大量的生物活性物質，包含前炎癥因子與前凝血因子，例如: P-選擇素\\( P-selectin\\) 、E-選擇素\\( E-selectin\\) 、細胞間黏附分子-1\\( intercellular adhesion molecular-1，ICAM-1\\) 和血管細胞黏 附 分 子-1 \\( vascular cell adhesion molecular-1，VCAM-1\\) 和血管假性血友病因子 \\( von Willebrandfactor，vWF\\) 等，這些分子與細胞黏附、炎癥、血栓形成及止血密切相關。有報道顯示血壓升高引起的牽張力長期作用于血管內皮細胞會引起炎癥因子釋放增加，多種細胞黏附分子表達水平升高，機械性牽張力通過改變內皮細胞表面血管黏附分子和栓塞分子的表達來調節炎癥反應和血栓形成。我們前期研究發現 P-selectin 在機械性牽張力誘導的炎癥細胞黏附過程中發揮十分重要的作用，它可以明顯促進炎癥細胞黏附，而 VCAM-1 在受血管牽張力刺激后在黏附過程中是否起作用以及 P-selectin 和 VCAM-1引起的炎癥細胞黏附能力強弱的比較還未見報道。
1 材料和方法
1． 1 材 料
HL-60 人白血病淋巴母細胞樣細胞株來自于ATCC 細胞庫，M199 培養基、胎牛血清購自 Gibco 公司，青霉素、鏈霉素和化學試劑購自 Sigma 公司; 小鼠抗 P-selectin 抗體、小鼠抗 VCAM-1 抗體和 IgG2a 同型對照抗體購自 BD 公司; S100 倒置相差顯微鏡、體視顯微鏡購自 Nikon 公司、國產玉兔牌血壓計購自北京王府井醫藥器械公司、離體血管分析儀購自 Living systems 公司、XC-ST50CE 型攝像機及顯示器購自 SONY 公司、注射泵購自 HAＲVAＲD 公司; 8 ～ 10 周C57BL /6J SPF 級小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。
1． 2 方法
本實驗是建立在離體小鼠頸總動脈上的黏附模型。實驗前用血壓計校準壓力感受器、校準血管直徑測量標尺，并用生理鹽水灌流血管分析儀液體循環管道并排空氣泡。
1． 2． 1 不同牽張力刺激小鼠頸總動脈誘導 HL-60 細胞黏附實驗 小鼠左右頸總動脈分離后在 0． 01 g/L BSA 的 M199 中饑餓處理 2 h，接入由注射泵、血管灌流槽和三通管組成的灌流系統，并由壓力感受器實時監測血管條內部的壓力。用生理鹽水平衡 15 min，然后通過調節血管內部壓力，分別維持在75、100、125、150 mmHg 下處理30 min，測量血管直徑。用含0． 01 g / L BSA 的 M199 重懸HL-60細胞，計數后將 5 × 106/ mLHL-60 細胞約 3 mL 緩慢灌入血管腔，靜置 30 min，使其與血管壁相互作用并黏附。為了避免因液體流動帶來的剪切力，灌流速度設置為 0． 37 mL/min。最后用生理鹽水在低壓下灌流10 min，沖洗掉未黏附的細胞，在 10 倍物鏡下拍照。實驗結果由每個視野中黏附的細胞數得來。
1． 2． 2 高機械牽張力刺激下 VCAM-1、P-selectin 影響 HL-60細胞黏附實驗 小鼠左右頸總動脈分離、預處理和灌流系統連接同上，由壓力感受器實時監測血管條內部的壓力。用生理鹽水平衡 15 min，然后分別灌流含有小鼠 VCAM-1 抗體、同型 IgG 對照抗體以及 P-selectin 抗體的生理鹽水，濃度為10 μg / mL，通過調節血管內部壓力，維持在 150 mmHg，對血管做30 min 預處理，以75 mmHg 做對照。為了避免因液體流動帶來的剪切力，灌流速度設置為 0． 37 mL/min。用含0． 01 g / L BSA 的 M199 重懸 HL-60 細胞，計數后將 5 × 106/ mLHL-60細胞約 3 mL 緩慢灌入血管腔，分別維持在150 mmHg或75 mmHg 靜置 30 min，使其與血管壁相互作用并黏附。最后用生理鹽水在低壓下灌流 10 min，沖洗掉未黏附的細胞，在10 倍物鏡下拍照。實驗結果由每個視野中黏附的細胞數得來。
1． 2． 3 統計學分析 所有數據采用 SPSS20． 0 進行統計分析，結果以 x ± s 表示，以單因素方差分析，P ＜ 0． 05 表示差異有統計學意義。
2 結果
2． 1 機械牽張力引起小鼠頸動脈內皮細胞上 HL-60細胞黏附增加
小鼠頸總動脈管腔內壓力從 75 mmHg逐漸升高至 150 mmHg，血管隨之直徑加大，高壓下管腔直徑相對于低壓時擴大約 150% \\( 圖 1A\\) ，隨著壓力升高，血管及內皮細胞受到的機械牽張力也隨之加大。血管內皮細胞在不斷增大的牽張力的刺激下，使得 HL-60 細胞黏附逐漸增多，證明機械牽張力能引起 HL-60 細胞在內皮細胞上黏附，并呈明顯的牽張強度依賴性\\( 圖 1B\\) ?！緢D略】
2． 2 機械牽張力通過 VCAM-1 和 P-selectin 介 導HL-60 細胞的黏附
為證明黏附過程是由 VCAM-1參與 完 成 的，在 加 入 HL-60 細 胞 之 前 分 別 用10 μg / mL VCAM-1 中和抗體、非特異的同型 IgG 對照抗體和 P-selectin 中和抗體，分別對不同的血管條進行預處理。結果表明高腔內壓能顯著的引起由VCAM-1 參與的 HL-60 細胞黏附過程，高壓處理后的血管壁上黏附的 HL-60 細胞明顯多于低壓處理組，而加入 VCAM-1 中和抗體、P-selectin 中和抗體預處理后的血管，HL-60 細胞黏附數目與非特異性 IgG 預處理后的黏附細胞數目相比有顯著的降低，IgG 組與高壓組無明顯區別\\( 圖 2 \\) 。從而證明了機械牽張力通過引起 VCAM-1 在細胞膜上的轉移增加來促進HL-60細胞的黏附，其作用與 P-selectin 介導的細胞黏附水平相似?！緢D2略】
3 討論
血管及其內皮細胞在心臟有規律搏動輸出血液的刺激下，受到平行于血管的剪切力和垂直于血管的牽張力兩種機械力作用，其中牽張力是內皮細胞感受的重要機械力之一，其廣泛存在于多種生理、病理條件下。多項研究表明，高血壓時動脈系統擴張，引起牽張力增加，異常的機械力作用于內皮細胞造成內皮受損，細胞內信號轉導通路被激活，導致一系列炎癥因子釋放增加，炎癥細胞活化后釋放多種酶，溶解破壞內皮細胞，引發的炎癥反應使血管壁增厚，造成血管硬化、血管阻力增高血壓升高。有文獻報導機械力通過激活細胞膜上多種信號分子，引起內皮細胞內復雜的信號轉導，這些轉導通路對于調節內皮細胞的形態、功能和基因表達起著重要的作用。因此，深入研究機械力學刺激導致或加重高血壓形成的機制，減少炎癥因子產生，對于預防高血壓的發生發展有著重要作用。
目前的研究大部分局限于內皮細胞黏附作用的探討，而對離體組織器官的研究則相對缺乏，故本研究主要針對機械牽張力對離體小鼠頸動脈內皮的作用及細胞黏附展開。為了模擬高血壓時血管受力情況，實驗采用 Living systems 血管加壓裝置，通過施加不同程度的靜水壓，模擬體內升壓所致動脈內皮受到不同的牽張應力。內皮細胞表面存在多種炎癥細胞黏附因子，目前有關 P-selectin、VCAM-1 等糖蛋白分子研究較多。先前，我們證明了 P-selectin 在牽張力引起的細胞黏附過程中起重要作用，VCAM-1 是否也在其中起作用還不得而知。VCAM-1 是表達于血管內皮細胞膜上的免疫球蛋白黏附分子，可與白細胞表面的 VLA-4 整合蛋白相結合，引起白細胞在內皮細胞表面滾動、黏附?，F已證實血液流動剪 切 力 可 引 起 黏 附 分 子 調 控 變 化， VCAM-1、E-selectin 都具有剪 切 應 力 的 依 賴 性，提 示VCAM-1 在牽張力引起的細胞黏附過程中有可能起一定的作用。
本研究結果首先顯示牽張力可以顯著刺激HL-60細胞黏附，并呈壓力強度依賴性關系。接著，我們就VCAM-1 在機械牽張力誘導血管炎癥細胞黏附過程中的作用進行了探討。我們發現機械牽張力不僅可以影響由 P-selectin 介導的 HL-60 細胞黏附，同時也可以通過調控 VCAM-1 的變化來影響 HL-60 細胞黏附，并且水平接近。
綜上所述，本研究結果顯示 VCAM-1 和 P-selectin參與了由牽張力誘導的 HL-60 細胞黏附過程，提示機械牽張可以誘導多種細胞因子參與炎癥反應。目前該結論僅來自于離體小鼠頸動脈的黏附模型，VCAM-1 和 P-selectin 引起細胞黏附增多的分子機制以及體內血壓升高時細胞黏附的情況，還有待于在分子水平、高血壓動物模型上得到進一步揭示和驗證。深入研究機械牽張力調控炎性細胞黏附的機制，將有助于豐富和完善高血壓發病機制的理論，降低血栓和高血壓的發生，為探索新的臨床治療方法提供思路。
參考文獻:
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