支氣管哮喘是氣道對非特異性刺激高反應應答的一種慢性炎癥性疾病,過敏原的吸入引起雙相的、可逆的氣流阻塞。氣道重塑是哮喘的重要病理特征,氣道重塑的發生不僅出現在哮喘的晚期,而且出現在哮喘的早期,并呈持續性進行性加重。神經生長因子\\(NGF\\)屬于神經營養因子家族成員,在肺組織內的多種結構細胞和炎性細胞均有表達,有研究結果表明,NGF可能參與哮喘氣道炎癥、高反應性及氣道重塑。胰島素樣生長因子-Ⅰ\\(IGF-Ⅰ\\)能誘導成纖維細胞及氣道平滑肌增生,并抑制其凋亡,并促進細胞間黏附因子-Ⅰ\\(ICAM-Ⅰ\\)的表達,加重氣道炎癥反應。本文制備大鼠慢性哮喘模型,觀察應用地塞米松\\(激素\\)后氣道平滑肌厚度、細胞核數、NGF、IGF-Ⅰ表達的變化,了解其對氣道重塑的影響和可能的作用機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及分組
清潔級雄性Wistar大鼠30只,體質量\\(120±20\\)g,先在實驗條件下觀察2d,無異常情況出現即開始用于實驗。隨機分為正常對照組、哮喘模型組、激素干預組,每組10只。
1.2 實驗方法
1.2.1 動物模型的制備參照文獻方法并進行改良:于第1、8天分別給予哮喘模型組和激素干預組大鼠腹腔內注射抗原液\\(含有卵蛋白1mg,氫氧化鋁100mg\\)1mL致敏。第15天開始使用超聲霧化器向霧化吸入箱內噴霧10g/L卵蛋白,每次持續30min激發哮喘,隔日1次,大鼠連續吸入12周。激素干預組在每次激發前30min腹腔注射地塞米松0.5mg/kg?？乖ぐl后,以大鼠出現頭、面部瘙癢,呼吸加深、加快,少動、弓背,嚴重者呼吸減慢或節律不整、輕度發紺、四肢無力、反應遲鈍等為激發成功的標志。正常對照組以生理鹽水代替抗原液、霧化吸入的激發液及腹部注射的地塞米松。
1.2.2 取材與染色方法各組大鼠分別于末次激發后立即用10g/L戊巴比妥鈉腹腔注射\\(40mg/kg\\)麻醉,消毒開腹,腹主動脈采集動脈血進行血氣分析,以血氣結果作為哮喘嚴重程度的評定指標。
然后暴露胸腔,分離氣管,插入套管針,結扎右主支氣管,用生理鹽水10mL分3次灌洗左肺\\(第1次用3mL,第2次用3mL,第3次用4mL,每次在肺內停留約30s\\),回收液體,收集回收率高于80%的肺泡灌洗液\\(BALF\\),以2 000r/min離心15min,取上清液及細胞沉淀物分裝,行細胞總數及細胞分類計數。再經右心室插管至肺動脈,用生理鹽水快速沖洗后,取右肺中葉,置于40g/L甲醛中固定,常規石蠟包埋切片,行蘇木精-伊紅染色\\(HE染色\\)及免疫組化染色\\(SABC\\)。
1.2.3 氣道壁平滑肌厚度及炎性細胞浸潤觀察HE染色切片在顯微鏡下放大100倍,選擇橫斷面完整的同級別支氣管,測量呼吸道壁平滑肌厚度和支氣管平滑肌細胞核數。用光筆描繪出呼吸道基底膜周長及平滑肌內外邊界間寬度,平滑肌厚度\\(μm\\)為呼吸道基膜周長/平滑肌內外邊界間寬度。
1.2.4 NGF和IGF-Ⅰ表達測定SABC切片在高倍鏡下\\(400倍\\)觀察,應用IPP圖像分析軟件測定陽性表達區單位面積吸光度\\(A\\)值。
1.3 統計學方法
應用SPSS 17.0軟件進行統計分析,計量資料以x珚±s表示,多組間均數比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 各組哮喘發作情況
實驗選用大鼠30只,脫落3只,進入結果分析27只,其中正常對照組10只,哮喘模型組8只,激素干預組9只。正常對照組大鼠吸入生理鹽水后無明顯反應,肺部聽診無干濕性啰音;哮喘模型組和激素干預組在第3次霧化吸入卵蛋白后,大部分出現哮喘發作,表現為呼吸加深加快、口唇發紺、面部瘙癢、四肢無力、行動遲緩等,肺部聽診可聞及明顯哮鳴音;激素干預組霧化吸入卵蛋白后,哮喘發作癥狀較哮喘模型組逐漸減輕,第6次應用激素后已無明顯癥狀,肺部聽診可聞及少許哮鳴音。各組大鼠動脈血氣分析顯示,哮喘模型組、激素干預組二氧化碳分壓\\(PaCO2\\)明顯高于正常對照組,氧分壓\\(PaO2\\)明顯低于正常對照組\\(F=16.21、81.57,q=3.57~7.93,P<0.05\\);激素干預組大鼠與哮喘模型組比較PaCO2下降,PaO2升高\\(q=4.12~8.16,P<0.05\\)。見表1?！颈?】
2.2 各組肺組織病理改變比較
HE染色顯微鏡下觀察顯示,哮喘模型組肺組織結構輕度破壞,支氣管及血管周圍大量的炎性細胞浸潤,黏膜下水腫,黏膜褶皺增多,支氣管壁明顯增厚且不規則,支氣管平滑肌肥厚,管腔狹窄,膠原沉積;激素干預組大鼠肺組織支氣管上皮細胞的炎癥反應較哮喘模型組輕,支氣管壁及管腔內的炎癥細胞也較哮喘模型組大為減少;正常對照組大鼠肺組織結構正常,肺泡腔內有個別炎癥細胞滲出,支氣管平滑肌未見增厚。
2.3 各組大鼠 NGF和IGF-Ⅰ表達比較
NGF和IGF-Ⅰ主要表達在氣道上皮細胞的胞漿中,均為黃褐色顆粒狀物。哮喘模型組、激素干預組大鼠氣道壁組織NGF、IGF-Ⅰ表達及氣道平滑肌厚度和平滑肌細胞核數均 明顯 高 于 正 常 對 照 組\\(F=60.19~284.63,q=6.57~15.93,P<0.05\\),激素干預組上述指標結果明顯低于哮喘模型組\\(q=5.23~9.15,P<0.05\\)。見表2。
2.4 各組大鼠 BALF總細胞計數及細胞分類計數比較
各組大鼠BALF的細胞分類均主要為淋巴細胞,其次為單核細胞和中性粒細胞;正常對照組和激素干預組幾乎未見嗜酸性粒細胞,哮喘模型組可見少許。哮喘模型組、激素干預組BALF細胞總數及各種細胞計數均顯著高于正常對照組\\(F=10.69~554.12,q=3.41~23.43,P<0.05\\),而激素干預組明顯低于哮喘模型組\\(q=2.12~8.13,P<0.05\\)。見表3。
2.5 指標之間的相關性分析
哮喘模型組大鼠氣道壁中NGF、IGF-Ⅰ表達與氣道壁平滑肌厚度呈正相關\\(r=0.473、0.819,P<0.05\\),與BALF細胞總數和淋巴細胞數呈正相關\\(r=0.603~0.783,P<0.01\\)?！颈?-3】
3 討論
本實驗參照文獻采用卵蛋白霧化吸入的方法制備動物哮喘模型,此方法應用時間長,技術相對成熟。結果表明,大鼠的外觀表現、肺組織及支氣管病理改變符合人類哮喘的病理表現;血氣分析顯示,哮喘模型組大鼠存在低氧血癥和二氧化碳潴留,間接表明大鼠存在通氣功能障礙,肺部聽診可聞及明顯的哮鳴音,提示哮喘模型制備是成功的。
NGF是調節神經元發育,維持和修復損傷神經元的神經營養蛋白家族的一個成員。除了神經營養活性,NGF已被報道具有更廣泛的非神經元細胞的生物活性,比如參與整合刺激自適系統的成熟和表達。有研究顯示,表達于肺組織的NGF能夠增強T細胞和B細胞介導的免疫應答,誘導淋巴細胞分化和肥大細胞的增殖,促進嗜堿性粒細胞和嗜酸性粒細胞從外周祖細胞的分化。本文結果顯示,哮喘模型組大鼠NGF的表達與BALF的炎癥細胞總數和淋巴細胞數均呈正相關,與VIRCHOW等的結果相符;而哮喘是主要由嗜酸性粒細胞、肥大細胞和淋巴細胞等多種炎癥細胞參與的慢性氣道炎癥,提示氣道內NGF的表達可能通過多種炎癥細胞的增殖、分化參與哮喘的發生與發展。
除了神經細胞和炎癥細胞,氣道結構細胞也可能是NGF的靶細胞。有研究顯示,NGF能誘導人類肺成纖維細胞、血管平滑肌細胞收縮和遷移,還能導致內皮細胞增生。血管內皮生長因子\\(VEGF\\)能夠促進呼吸道平滑肌增生和血管生成,NGF能夠增加VEGF的釋放,間接促進血管產生和平滑肌的增生。本文結果顯示,哮喘模型組支氣管平滑肌厚度和細胞數目明顯增加,血管增生,提示發生氣道重塑改變,NGF的表達與氣道壁平滑肌厚度呈正相關,與文獻結果相符,表明NGF的表達增強在氣道重塑中起著重要的作用。本文哮喘模型組、激素干預組NGF的表達及平滑肌厚度均高于正常對照組,激素干預組低于哮喘模型組,表明糖皮質激素通過作用于肺內結構細胞中NGF的表達,抑制氣道重塑,但抑制作用并不完全。
IGF是一類多功能細胞增殖調控因子,具有種系穩定性,氣道上皮、腺體、肺成纖維細胞、巨噬細胞等均能合成和分泌,能夠通過促進ICAM-1的表達,使黏附于毛細血管內的炎癥細胞滲出,加重氣道炎癥。有研究表明,通過調節IGF-Ⅰ的濃度及其刺激過程可使氣道上皮細胞的生長達到最佳狀態,提示IGF-Ⅰ參與氣道上皮細胞的增生。本實驗結果顯示,哮喘模型組大鼠IGF-Ⅰ表達顯著高于正常對照組,平滑肌厚度及細胞核數明顯高于正常對照組,炎性細胞浸潤明顯,IGF-Ⅰ表達水平與氣道壁厚度及BALF細胞總數呈明顯正相關,表明IGF-Ⅰ通過調控氣道上皮細胞的增殖、炎性細胞的滲出在氣道重建及炎癥反應中起一定作用。其作用機制可能與IGF能與促炎癥類花生白三烯D4\\(LTD4\\)協同促進氣道平滑肌細胞\\(ASM\\)的有絲分裂有關。
研究已經證實,IGF-Ⅰ能在沒有其他生長因素的前提下刺激各種類型細胞的增殖,具有較強的抗凋亡作用。本文激素干預組IGF-Ⅰ和平滑肌厚度較哮喘模型組下降,炎癥細胞有所減少,與楊敏等和HOSHINO等研究結果相符,表明吸入糖皮質激素能夠降低哮喘大鼠氣道IGF-Ⅰ的表達和氣道壁厚度,抑制氣道炎性細胞浸潤,阻止氣道重建;而激素干預組各項指標均高于正常對照組,說明單純使用糖皮質激素并不能完全抑制哮喘氣道炎癥及重塑進展,具體機制尚需進一步研究。
綜上所述,NGF和IGF-Ⅰ表達影響哮喘病人氣道重塑和炎癥反應,應用糖皮質激素可部分抑制其作用,但具體機制尚待進一步研究。
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