microRNA-451是長約22nt的內源性非編碼小分子RNA,通過作用于靶mRNA使其降解或抑制其轉錄后翻譯,從而調控基因表達、細胞周期以及細胞的增殖與壞死。蛋白激酶B\\(P-AKT\\)是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶,活化的AKT通過磷酸化下游的許多靶蛋白,發揮其生物學活性,可以調節基因的轉錄、翻譯以及翻譯后加工,從而調節細胞周期,抑制細胞凋亡。肺移植已成為各種終末期肺部疾病的重要治療手段,而缺血再灌注損傷是影響肺移植成功率的最大制約因素。近年來,隨著micro-RNA及其下游調節機制影響腫瘤細胞增殖的研究不斷深入,其在缺血再灌注損傷中的作用也越來越受到關注,但在肺缺血再灌注過程中,microRNA及其下游調節蛋白的表達變化尚少有報道?；蛐酒夹g研究結果顯示,缺血肺組織中microRNA-451的表達量上調2倍以上。本實驗應用實時熒光定量PCR\\(RT-qPCR\\)及Western blot方法,檢測缺血再灌肺組織中microRNA-451及p-AKT蛋白的表達情況?，F將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康清潔級雄性Wistar大鼠50只,體質量為250~300g,均購自山東魯抗醫藥公司實驗動物中心;PrimeScriptRT reagent Kit及Premix ExTaqTM,均購自大連寶生物工程有限公司;TaqManMicroRNA Assay Kit,購自Applied Biosystems公司;兔抗大鼠GAPDH單克隆抗體和山羊抗兔單克隆抗體,均購自康維世紀公司;兔抗大鼠p-AKT多克隆抗體,購自Santa Cruz公司。

1.2 實驗方法

Wistar大鼠50只,隨機分為對照組、缺血組、再灌注1h組、再灌注3h組、再灌注6h組,每組10只大鼠。麻醉大鼠,行氣管插管后接呼吸機,仰臥位固定大鼠,于胸骨左側第5肋間進胸,松解下肺韌帶,游離出肺門根部,手術中注意保護肺組織,避免組織損傷。予100U肝素靜注,5min后\\(肺中度膨脹時\\),于肺門處用血管夾阻斷血流,手術后碘附水沖洗胸腔,無菌敷料覆蓋切口。對照組于松解下肺韌帶后取材,不作血流阻斷;缺血組于阻斷肺門1h后取材;再灌注1、3、6h組于阻斷肺門1h后去除血管夾,恢復肺組織血供,分別于再灌注1、3、6h后取材,取材前予生理鹽水沖洗肺組織。阻斷上、下腔靜脈血流處死動物。穿刺左心耳,經右心室行壓力灌洗\\(30mL生理鹽水,2.94kPa\\),完整取出左全肺后,置液氮中-80℃保存。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1總RNA、總蛋白提取及測定用TRIzol及microRNA提取專用試劑盒,提取標本肺組織的總RNA,紫外線分光光度計測定吸光度\\(A\\)值。蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑中研磨并超聲裂解肺組織,離心,加SDS后水浴,-20℃保存。

1.3.2 microRNA-451蛋白表達檢測采用RT-qPCR方法,通過microRNABase及相關文獻獲取其引物序列。microRNA-451引物序列:5′-AAA-CCGUUACCAUUACUGAGUU-3′,應 用Prime-ScriptRT reagent Kit試劑盒TaqMan探針分析法進行逆轉錄,逆轉錄產物cDNA置-20℃冰箱保存備 用。按 照Premix Ex Taq及TaqManMi-croRNA Assay Kit試劑說明書進行PCR標準程序擴增,U6為內參\\(引物序列為5′-GTGCTCGCTTC-GGCAGCACATATACTAAAATTGGAACGATA-CAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAG-GATGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTCCAT-ATTT-3′\\),檢測microRNA-451相對表達量。

1.3.3 P-AKT蛋白表達檢測采用Western blot方法,以GAPDH作為對照,行SDS-PAGE電泳。

電泳完成后轉至硝酸纖維膜上,室溫下封閉2h,TBST緩沖液洗3次,加入兔抗大鼠p-AKT多克隆抗體\\(1∶1 500\\),4℃孵育過夜;用TBST漂洗3次,加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗\\(1∶4 000\\),室溫孵育1h;TBST及TBS各洗3次,ECL系統曝光顯影,凝膠分析系統分析p-AKT蛋白的表達。實驗重復3次。

1.4 統計學處理應用SPSS 19.0軟件進行統計學處理,數據間比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗法,以P<0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 各組microRNA-451表達比較對照組、缺血組、再灌注1h組、再灌注3h組、再灌注6h組microRNA-451相對表達量分別為0.39±0.34、1.79±1.27、1.86±0.98、2.08±1.44、0.58±0.63。與對照組比較,缺血組、再灌注1h組、再灌注3h組、再灌注6h組microRNA-451的相對表達量呈現先上調后下調的趨勢,其中再灌注3h組microRNA-451的表達量最高,差異有顯著意義\\(F=17 244.32,P<0.05\\)。

2.2 各組p-AKT蛋白表達比較對照組、缺血組、再灌注1h組、再灌注3h組、再灌注6h組的p-AKT蛋白相對表達量分別為0.32±0.01、0.18±0.02、0.16±0.01、0.13±0.01、0.21±0.02。對照組AKT蛋白相對表達量最高,再灌注3h組表達量最低,差異有顯著性\\(F=136.02,P<0.05\\)。

3 討論

microRNA是一類內源性非編碼小RNA,具有高度保守的基因序列,在RNA聚合酶Ⅱ的催化下細胞核內轉錄出序列較長的pri-microRNA,經過Drosha酶及Dicer酶的修飾可形成成熟的micro-RNA,它可與序列基本互補的mRNA結合,通過阻止蛋白質翻譯過程或直接降解mRNA,實現基因表達的調控作用,從而影響細胞的增殖、分化、凋亡、新陳代謝等過程。NAN等研究結果顯示,micro-RNA-451可抑制膠質瘤細胞生長、增殖,促進細胞的凋亡。WANG等研究結果顯示,microR-451可靶向調控RAB14,從而顯著抑制非小細胞肺癌生長。

BRANDRES等研究顯示,microRNA-451在胃及結直腸癌中呈低表達,且表達水平與預后呈正相關,將pre-microRNA-451轉染入結直腸癌細胞中,腫瘤細胞生長受到抑制。TIAN等研究顯示,人腦膠質瘤細胞中microRNA-451可通過CAB39抑制PI3K/AKT途徑,從而抑制腫瘤細胞生長。

AKT蛋白是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶,它處于PI3K/Akt信號轉導通路的核心部位,可通過PDK-1磷酸化Thr308、Ser473兩個位點后,實現完全激活,發揮生物學活性。近年來,對于p-AKT的研究不斷深入,大量研究證實,AKT蛋白具有促進細胞生長增殖,抑制細胞凋亡的作用。已有研究結果顯示,p-AKT蛋白在非小細胞肺癌、胰腺癌、甲狀腺癌、乳癌、卵巢癌、胃癌及結直腸癌等組織中均表達增高。WIDMANN等研究結果顯示,細胞凋 亡 時,AKT可 出 現 水 解 現 象,表 達 量 降 低。JETZT等將AKT的磷酸化位點滅活,通過一種復制缺陷型腺病毒將失活的AKT轉入腫瘤細胞,發現腫瘤細胞的增殖受到抑制。

本研究應用RT-qPCR以及Western blot法,檢測microRNA-451及P-AKT蛋白在大鼠肺缺血再灌注組織中的表達情況,結果顯示兩者在表達上存在一定的相關性。結合相關文獻結果,認為microRNA-451可能通過調節p-AKT蛋白的表達對細胞的增殖和凋亡發揮作用。本文的實驗結果顯示,隨著缺血再灌注時間的延長,microRNA-451的表達呈現先上調后下降的趨勢,而p-AKT蛋白的表達則是呈現先下降后上調的相反的結果,推斷microRNA-451促進細胞凋亡的作用可能是通過調節p-AKT蛋白通路實現的。這有可能為肺缺血再灌注損傷的預防及治療提供一條新的思路。但是,microRNA-451對p-AKT蛋白調節的具體機制尚需要進一步研究。microRNA-451是否存在其他靶點對缺血再灌注損傷進行調控及p-AKT蛋白調控細胞周期的具體機制目前尚未得到證實。