自上世紀 60 年代發現鐵氧化還原蛋白（ferredoxin） 以來，人類已發現了超過 120 種含鐵硫簇的蛋白質和酶，即鐵硫蛋白 （ iron-sulfurprotein）[1]. 鐵硫簇 （ iron-sulfur cluster,ISC） 是生物體內最古老的無機輔助因子之一，它作為蛋白質的活性基團，參與調節酶活性、線粒體呼吸、核糖體和輔助因子合成，以及基因的表達調控[2]. 近 10 年來發現，多種疾病的發生均與鐵硫蛋白生物合成異常有關，把鐵硫蛋白的研究推向新的高潮。 而國內對鐵硫蛋白的研究甚少，有文獻報道亦是側重結構和生物合成的簡要敘述。 本文就鐵硫蛋白的結構、功能與生物合成過程作一綜述，并介紹鐵硫蛋白相關疾病的發生機制。
1 鐵硫蛋白的結構與功能
鐵硫簇由鐵離子和硫離子組成，它既可作為電子傳遞蛋白質的輔基參與能量轉移，又可作為某些酶的活性基團參與各種生化反應。 鐵硫簇中的鐵離子常與蛋白質的半胱氨酸殘基結合，少量與組氨酸、精氨酸、色氨酸殘基結合[3]. 最簡單的鐵硫簇只含有 1 個鐵原子，與 4 個半胱氨酸的硫原子結合形成四面體，即 Fe-（Cys）4簇。 最常見鐵硫簇是菱形的[2Fe-2S]簇和立方體的[4Fe-4S]簇[4,5]. [2Fe-2S]簇由 2 個鐵離子和 2 個硫離子構成，其中每個鐵離子還與 2 個半胱氨酸殘基結合。 目前認為，[4Fe-4S]簇是由 2 個[2Fe-2S]簇重組而形成的，即 4 個鐵離子和 4 個硫離子相間排列在正六面體的 8 個頂角處，此外每個鐵離子還與 1 個半胱氨酸殘基相連。 某些蛋白質如呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ結合有[3Fe-4S]簇，被認為是由[4Fe-4S]簇丟失 1 個鐵離子形成的。 近年來，逐漸發現結構較復雜的鐵硫簇，如施氏芽孢桿菌和巴氏著色菌的 ferredoxin 中分別含有[7Fe-8S]、[8Fe-8S]簇，固氮菌的鐵鉬蛋白中有[7Fe-9S-Mo]簇[6]. 在生物體內 1 種蛋白質可結合多個多種鐵硫簇，如呼吸鏈復合物Ⅰ含 8 個鐵硫簇[7,8],呼吸鏈復合物Ⅱ含有[2Fe-2S]、[3Fe-4S]、[4Fe-4S]簇。
各種鐵硫簇鑲嵌到脫輔基蛋白（apo-protein）中形成多種鐵硫蛋白，共同完成各種生物學功能。 最主要的功能是參加各種氧化還原反應，這是因其輔基中的鐵離子能在 Fe2 +和 Fe3 +間互相轉換[9]. 在人細胞中發現數十種鐵硫蛋白。 如分布在線粒體的呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,順烏頭酸酶、硫辛酸、生物素合成酶和鐵氧化還原蛋白等，它們參與電子傳遞、三羧酸循環、脂肪酸氧化以及硫辛酸、生物素、鐵硫簇等多種物質的合成[10]. 此外，分布在細胞質和細胞核的異丙基蘋果酸異構酶、亞硫酸還原酶、谷氨酸脫氫酶、黃嘌呤脫氫酶、DNA 糖基化酶和組蛋白乙酰轉移酶等，它們參與 DNA 復制、修復、tRNA 的修飾、端粒長度的維持和蛋白質翻譯等過程的調節[11]. 可見鐵硫蛋白是多種生化過程的關鍵酶，其結構功能異常與合成障礙均可引起機體代謝異?；蚬δ芪蓙y，甚至導致死亡。
2 鐵硫蛋白的生物合成過程
目前，在體外可以通過化學重組的方法合成鐵硫簇，并且可將其組裝到對應的脫輔基蛋白中[12].早期對鐵硫蛋白生物合成的認識來源于原核生物。
原核細胞內鐵硫蛋白的合成由固氮系統（nitrogenfixation system）、鐵硫簇組裝 系 統 （ ISC assemblysystem） 和硫同化系統（ sulfur assimilation system） 完成[13,14]. 而在真核細胞中，其合成則相對復雜，分為線粒體內和線粒體外合成 2 條途徑，分別由線粒體鐵硫簇合成系統（mitochondrial ISC assembly system）和細胞質鐵硫簇組裝器（cytosolic iron-sulfur clusterassembly,CIA） 完成。 鐵硫蛋白的生物合成過程在酵母和人類中有高度的保守性[15]. 目前，已發現 ISC系統由 17 種蛋白質，CIA 系統由 8 種（酵母）至 9 種（人類）蛋白質組成 （Table 1）。 本文主要以釀酒酵母為例，對真核生物鐵硫蛋白的生物合成進行詳細闡述。
2. 1 鐵硫蛋白在線粒體內的合成
線粒體是真核細胞鐵硫蛋白合成的關鍵部位。組成線粒體 ISC 系統的 17 種蛋白質幾乎均為細胞所必須，任何成分的缺失都會導致酵母細胞的死亡。ISC 系統是一個復雜的多步驟合成系統，根據反應的進程，人為地將線粒體內鐵硫蛋白合成分 3 步（Fig. 1）。
2. 1. 1 在支架蛋白 Isu1 上合成[2Fe-2S]簇 在酵母線粒體內有一種保守的支架蛋白 Isu1,它在鐵硫簇合成過程中作為反應平臺[20]. 半胱氨酸脫硫酶Nfs1 能夠催化半胱氨酸生成丙氨酸和硫離子，新生成的硫離子結合到 Nfs1 的半胱氨酸殘基上形成過硫化物（-SSH）。 Nfs1 與 LYRM 家族中的 Isd11 結合，形成復合物 Nfs1-Isd11,Isd11 起穩定 Nfs1 的作用[21]. 含-SSH 的 Nfs1-Isd11 復合物與 Isu1 緊密地結合后，將其中 1 個 S2 -轉移到 Isu1 上。
合成鐵硫簇還需要 Fe2 +作為原料，Fe2 +經線粒體膜轉運蛋白 Mrs3/4 轉運到線粒體基質。 Fe2 +再經具有鐵結合功能的 Yfh1 蛋白（人類 Frataxin）運輸至Nfs1-Isd11-Isu1 復合物。 Fe2 +從 Yfh1 轉移至 Isu1,并與 S2 -相互作用生成[2Fe-2S]簇，此時新生成的[2Fe-2S]簇以松散狀態結合在 Isu1 上。 Yfh1 在鐵轉運過程中發揮關鍵作用，異常時可導致酵母細胞鐵堆積。 Gerber 等[22]和 Schmucker 等[23]發現，人類Frataxin 與 NFS1-ISD11-ISU1 復合物結合失敗時，會導致紅細胞內鐵超載。 此外，Frataxin 對 NFS1 有變構調節的作用，當反應過程中所有成員都出現時，Frataxin 會激發 NFS1 的活性[24].
在[2Fe-2S]簇合成時，還需要由 NAD（P）H、鐵氧化還原蛋白 Yah1 和鐵氧化還原蛋白還原酶Arh1（ ferredoxin reductase,Arh1 ） 構成的電子鏈參與[25]. Yah1 本身就是[2Fe-2S]蛋白，在 Arh1 作用下被還原，釋放的電子經 NAD（P）H 轉移到 Isu1的-SSH 上。
2. 1. 2 分子伴侶協助[2Fe-2S]簇轉移到 Grx5[2Fe-2S]簇在 Isu1 合成后，要進一步組裝到目標蛋白質上，中途需要熱休克蛋白70（heat shock protein,Hsp70）分子伴侶系統和谷氧還蛋白 5（glutaredoxin5,Grx5） 協助其解離及轉運。 Hsp70 分子伴侶系統包括腺苷三磷酸酶 Ssq1、DnaJ 樣分子伴侶 Jac1、核酸交換因子 Mge1[26-28]. Ssq1 與 Isu1 的功能類似，作為支架蛋白質提供反應平臺[16]. Jac1 通過 J 結構域與Isu1 結合，募集下游分子聚集[29]. Mge1 在運輸后期出現，將 ADP-Ssq1 轉化為 ATP-Ssq1,使結合在 Ssq1的各組分解離[30]. Grx5 是 1 種鐵硫簇轉運蛋白，通常以二聚體的形式存在，能夠通過半胱氨酸殘基活性位點與[2Fe-2S]簇結合。
首先，[2Fe-2S]簇與 Isu1 結合形成 Holo-Isu1復合物，接著 Jac1 特異地與 Holo-Isu1 結合，形成Jac1- Holo-Isu1 復合體。 該復合體能結合 ATP,啟動下游反應，這導致 ATP-Ssq1 變為 ADP-Ssq1. Isu1 的保守 LPPVK 環與 Ssq1 的多肽結合位點嵌合，形成Jac1-Holo-Isu1-ADP-Ssq1 復合物。 Ssq1 與 Isu1 結合后，其構象發生改變，進一步增強與 Isu1 的結合。 而Isu1 自身結構卻變得松散，與[2Fe-2S]簇和 Jac1 的結合力均減弱，使得 Jac1 從復合物中分離。 隨后apo-Grx5 向 Ssq1 靠近，并與之結合。 Ssq1 以不同的位點同時結合 Isu1 和 Grx5,拉近了兩者的距離，提高 [2Fe-2S]簇從 Isu1 移至 Grx5 的效率[31]. 反應后期，Mge1 出現并結合至 Ssq1 上，驅使 ADP 轉換為ATP,最終導致結合在 Ssq1 上的組分都解離[32]. 此時 Grx5 攜帶的[2Fe-2S]簇經 ISC 途徑或 CIA 途徑，繼續參與鐵硫蛋白合成的后續過程。 而 Isu1 和其它分子伴侶將進入下一個周期，參與下一個鐵硫簇的轉移。
Ssq1、Jac1、Mge1、Grx5 都是線粒體鐵硫蛋白合成的重要成員，它們基因的缺失會直接降低酶活性和出現細胞內鐵的堆積等[33]. 另外，此步反應還產生了一種功能仍不清楚的含硫復合物（X-S），并已證實 X-S 經過載體運輸到線粒體外后，可以調控胞質鐵硫蛋白的合成。
2. 1. 3 鐵硫簇目標因子協助 [4Fe-4S]蛋白合成第二步中釋放出來的[2Fe-2S]簇，可直接與脫輔基蛋白質或多肽鏈中氨基酸殘基結合形成[2Fe-2S]蛋白，而[4Fe-4S]蛋白的形成相對較復雜。[4Fe-4S]簇是由 Grx5 上的[2Fe-2S]簇變構重組而成，這中間需要 3 種蛋白質參與，包括在 Isa1、Isa2 和四氫葉酸結合蛋白 Iba57,三者稱為 ISC 目標因子（ISC targeting factors）[34]. 三者是[4Fe-4S]蛋白合成的特異因子，單個基因缺失后，鐵硫蛋白依然可以合成，這與它們在功能上存在互補作用有關。 但三者是如何相互協調促進[4Fe-4S]簇合成的機制尚不明確。 現已知 Isa1 和 Isa2 在體內外都具有鐵結合功能，人們仍在探索它們的生理功能，試圖不斷完善該機制。
Ind1、Nfu1、Aim1 是 3 個具有特異性綁定及運輸[4Fe-4S]簇功能的分子。 Ind1 可短暫結合[4Fe-4S]簇并將其輸送到呼吸鏈復合體Ⅰ上，使復合體Ⅰ具有完整功能[35]. 相對來說，Nfu1 作用更廣泛，除了參與復合體Ⅰ的成熟外，還參與復合體Ⅱ和硫辛酸合酶（lipoate synthase）等多種蛋白質的成熟[36].
Aim1 與 Nfu1 的功能相似，兩基因缺失后的表型相同，這是由于它們具有相互協調作用。 也有某些[4Fe-4S]蛋白的合成不需要這些特異性分子的參與，如順烏頭酸酶。經過上述 3 步反應后，線粒體內多種[2Fe-2S]、[4Fe-4S]蛋白被合成，它們以酶或功能蛋白質的形式參與各種重要的生化過程。 值得注意的是，雖然將線粒體內鐵硫蛋白的生物合成過程分 3 步講述，但實際上是互相重疊，同時進行的。
2. 2 鐵硫蛋白在線粒體外的合成
隨著對鐵硫蛋白生物合成過程的研究加深，人們發現了位于線粒體之外的鐵硫蛋白合成系統-CIA 系統。 CIA 系統專門參與細胞質和細胞核鐵硫蛋白的合成，而有別于 ISC 系統。 CIA 系統成員缺失后，主要影響細胞質和細胞核的鐵硫蛋白，而不會影響線粒體內鐵硫蛋白的合成。 相反，線粒體 ISC 系統成員的異常會明顯地干擾細胞質鐵硫蛋白的合成。
如 ISC 系統的 Isu1、Nfs1-Isd11 和載體 Atm1（人類ABCB7） 的異常，將導致線粒體外硫蛋白合成減少[37]. 特別是 Atm1 的缺失，無法將含硫復合物運輸至線粒體外，從而影響線粒體外鐵硫蛋白的合成。 在酵母、斑馬魚、小鼠和人類細胞中，表現出鐵硫蛋白的含量減少或活性降低的表型[38]. 在線粒體外合成的鐵硫蛋白大多是[4Fe-4S]蛋白，大致可以分為兩步（Fig 2）。
2. 2. 1 [4Fe-4S]簇的合成 Cfd1 和 Nbp35 都屬于 NTPases 家族成員，一般以 2Cfd1-2Nbp35 四聚體形式存在，在合成過程中既起支架作用，又可以綁定 2 對[4Fe-4S]簇。 其中 1 對[4Fe-4S]簇的合成需要線粒體提供含硫復合物作為原料，含硫復合物經線粒體膜 Atm1 載體運出，在 Cfd1-Nbp35支架上合成，然后結合至 Cfd1. 另 1 對[4Fe-4S]簇的合成則需要 NADPH-Tah18-Dre2 電子鏈的參與，Dre2 本身就是[2Fe-2S]蛋白，在 Tah18 的還原下，[2Fe-2S]簇被釋放，其中的電子來自 NADPH. 2 個[2Fe-2S]簇經重組后形成[4Fe-4S]簇，并綁定到Nbp35 的 N-氨基末端，最終 Cfd1-Nbp35 綁定了 4個[4Fe-4S]簇。
2. 2. 2 [4Fe-4S]簇至脫輔基蛋白質的轉移 此階段 需要 Nar1 蛋白 和 CIA 目標復合物 （ CIAtargeting complex） 的共同參與[40]. Nar1 與 ISC 系統中 Grx5 的功能類似，可捕獲 Cfd1-Nbp35 上的[4Fe-4S]簇，起轉運作用。 Nar1 缺失后，酵母細胞質鐵硫蛋白合成受阻，對氧化劑敏感，ROS 含量升高，細胞受損，壽命縮短[41,42]. 近期發現，在 Nar1運載[4Fe-4S]簇時，還有與 Grx5 同家族的 Grx3,Grx4 的協助[43,44]. Grx3,Grx4 能 綁 定[2Fe-2S]簇，調節細胞內鐵平衡。 CIA 目標復合物包括 Cia1、Cia2 和 Mms19,其中 Cia1 和 Cia2 是酵母生存的必需蛋白質。 Cia1 是分子量為 WD40-repeat 蛋白家族成員之一，有 1 個β螺旋和 7 個反向片層結構，能夠與 Nar1 特異地結合，是 CIA 目標復合物的活性結合位點[45]. Cia2 含有 1 個高度活躍的半胱氨酸殘基，其能夠與鐵硫簇中的鐵離子結合并發揮搬運作用。 Mms19 不是酵母生存的必需蛋白質，但是缺失后會使酵母壽命縮短，HeLa 細胞復制代數減少，小鼠胚胎早期死亡[46,47]
. 研究發現，Mms19 缺失菌株的轉錄因子 Rad3（DNA 解旋酶）的表達量降低[46]. 在這個傳遞過程中，鐵硫簇的結構也發生改變，使它們能夠鑲嵌到多種脫輔基蛋白質的活性位點中，形成各種鐵硫蛋白。
細胞質內組裝成熟的鐵硫蛋白，在細胞內經過分選后進入相應的亞細胞器，細胞核鐵硫蛋白則在其攜帶的核定位信號 （nuclear localization signal,NLS） 的指引下主動運送到細胞核，最終發揮它們的生物學功能。
3 鐵硫蛋白相關性疾病鐵硫蛋白合成的異常會影響
酵母的壽命和抵御環境壓力的能力。 而在人類中則會引發多種疾病，這些疾病統稱為鐵硫蛋白相關性疾病。 目前，已確定人類十余種疾病與 ISC 或 CIA 系統成員的基因有關（Table 2），其中較常見的是弗里德賴希共濟失調（friedreich ataxia,FRDA）、遺傳性肌病 （hereditarymyopathy） 和鐵粒幼細胞性貧血 （ sideroblasticanemia）[48]. 這些疾病雖然比較罕見，但是會嚴重影響患者的生活質量和壽命[16].
FRDA 是因神經元進行性變性壞死，導致以中樞神經系統損害為主的 1 種常染色體隱性遺傳病[49]. 正常人 FXN 基因（ 編碼 Frataxin 蛋白） 第 1 個內含子含有 8 ~33 個 GAA 重復序列，而 FRDA 患者常多于 90 個，并且異常重復次數越多，病情越嚴重[50]. GAA 序列重復擴增會阻礙 FXN 基因的轉錄，導致患者細胞內 Frataxin 表達量減少[51]. 而Frataxin 正是線粒體基質內將 Fe2 +轉運到支架蛋白ISCU 上的重要運載體。 Frataxin 的缺乏會導致鐵硫簇合成障礙，患者體內呼吸鏈復合物Ⅰ、順烏頭酸酶、琥珀酸脫氫酶等多種以鐵硫簇為輔基的蛋白質的酶活性和含量均降低[52]. 線粒體電子傳遞和三羧酸循環的失調，會導致機體能量供應不足。 此外，線粒體內鐵的利用減少，導致線粒體內鐵不斷堆積，而鐵硫簇匱乏，形成負反饋，使更多的鐵被轉運至線粒體，引發鐵的惡性積累[53]. 鐵本身也是一種氧化損傷劑，大量積累必然導致細胞損傷、凋亡甚至壞死。
目前認為，Frataxin 的缺乏會導致線粒體功能受損，進而引發多條細胞信號通路發生改變，放大了Frataxin 缺失的生理學效應，這也是致使 FRDA 患者出現全身功能衰退的直接原因。遺傳性肌病是以全身骨骼肌萎縮為主要特征，患者在輕微運動后易出現勞累、肌肉酸痛、呼吸短促等癥狀的終身運動耐受疾病[54]. 經過大量研究發現，患者多因 ISCU 基因（編碼支架蛋白 ISCU）第 3個外顯子的第 149 個堿基發生了 G→A點突變，導致 ISCU 的第 50 位上的甘氨酸被谷氨酸取代[55];此外，ISCU 的第 7 044 個堿基發生 G→C突變，會導致終止密碼子的提前出現，使蛋白質翻譯提前終止[56];這兩種突變都影響細胞內正常 ISCU 的含量和功能。 患者在非急性期時檢查顯示，呼吸鏈復合物Ⅲ、順烏頭酸酶、琥珀酸脫氫酶等活性下降，肌肉病理切片出現肌細胞數減少并萎縮；急性期時可出現血氧飽和度下降，血乳酸和丙酮酸濃度升高，重者甚至出現橫紋肌溶解和肌紅蛋白尿[57]. 這類患者的ISCU 合成異常，使得鐵硫簇合成時缺少促進鐵離子和硫離子相互作用的平臺。 從而導致鐵硫簇的合成受阻，線粒體功能受損，特別是呼吸鏈功能不全，氧利用降低。 因此，患者較正常人對缺氧更敏感，糖酵解途徑增強，相應地乳酸、丙酮酸等有害物質增多，其中骨骼肌需氧量最大，受損最為嚴重。
鐵粒幼細胞性貧血是較為常見的鐵硫蛋白異常相關疾病，多見家族聚集發病。 患者的 GLRX5 基因第 1 個外顯子最后 1 個密碼子的第 3 個堿基發生了A→G突變，導致錯誤的剪接識別位點出現使正常的 GLRX5 表達量下降[58]. 細胞內 GLRX5 表達量的減少雖然不會干擾線粒體內[2Fe-2S]簇的正常合成，但是 GLRX5 作為[2Fe-2S]簇的轉運載體，會降低[2Fe-2S]簇與脫輔基蛋白的結合，[4Fe-4S]蛋白的合成和傳遞至細胞質的含硫復合物也減少。 正常情況下，細胞內的鐵調節蛋白 1 （ iron regulatoryprotein 1,IRP1）與 [4Fe-4S]簇結合，維持細胞內鐵平衡；當 IRP1 未能結合[4Fe-4S]簇時，IRP1 就會被過度激活并與多種血紅素轉錄因子 mRNA 的 5‘或3’非翻譯區 （ untranslated regions,UTR） 結合，促進aminolevulinate δ、synthase 2（ALAS2）等血紅素合成轉錄因子的生成[58]. 血紅素主要存在于紅細胞內，因此，大量鐵被轉運到紅細胞內。 人 GLRX5 突變后出現小細胞鐵粒幼細胞性貧血 （ microcyticsideroblastic anemia）[59];斑馬魚則可引起低色素性貧血 （hypochromic anemia），甚至出現胚胎致死[60].
上述鐵硫蛋白缺陷患者多在兒童期或少年期發病，患者一般都會出現細胞鐵超載、酶活性降低、機體代謝紊亂等病癥。 隨著年齡的增長，病情逐漸加重，最終多死于心血管系統疾病。 這些疾病幾乎都是全身性疾病，不同疾病可出現相同的臨床癥狀和體征。 疾病的診斷和鑒別診斷主要根據臨床病史、機體功能測試以及實驗室檢測，其中最為精確的是進行基因序列分析，但費用相對比較昂貴[61]. 目前，對于這一類疾病的治療尚未有特異性的治療方法，多采用抗氧化劑、滅活自由基藥物、去鐵劑等進行對癥治療[62].在未來基因診斷和基因治療有望成為新的研究方向。
4 問題與展望
鐵硫蛋白種類繁多，參與眾多的生理過程，具有重要的功能。 但是其生物合成過程中，各組分之間是如何相互作用，相互調節還有待不斷完善和補充。 在人類及多種模式生物中均發現，ISC 或 CIA 系統組分的異?？蓪е麦w內細胞代謝紊亂、生理功能降低、個體壽命縮短、甚至死亡。 這些提示，鐵硫蛋白還可能參與到細胞應激、自噬、凋亡等多種生理過程。 隨著人們對鐵硫蛋白的結構、功能和生物合成研究的不斷深入，將有助于揭示相關疾病發生及發展機制，為尋找新的治療靶點提供理論基礎。
