激活素Ａ（ＡｃｔｉｖｉｎＡ，ＡｃｔＡ）是轉化生長因子β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－β，ＴＧＦ－β）超家族成員之一，其作為ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ信號通路的第一信使，通過觸發下游細胞內Ｓｍａｄｓ級聯反應，完成具有一定生物學功能的信號轉導過程。前期研究發現ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ通路具有抗缺血損傷的神經保護作用。但其相關信號轉導及調節機制尚需進一步研究，本研究以該通路中重要的細胞內調節因子Ｓｍａｄ７為靶點，利用ＲＮＡ干擾技術抑制Ｓｍａｄ７基因表達，檢測其對ＰＣ１２細胞ＯＧＤ損傷及ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ通路活化水平的影響，探討Ｓｍａｄ７對ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ通路的調控機制。
１材料和方法
１．１主要材料
大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤ＰＣ１２細胞系購自中國醫學科學院腫瘤細胞庫。兔抗大鼠ＡｃｔＡ、Ｓｍａｄ７、β－ａｃｔｉｎ抗體購自Ｓａｎｔａ公司，羊抗兔二抗購自鼎國公司，鼠神經生長因子（ＮＧＦ）購自Ｓｉｇｍａ公司，Ｔｒ－ｉｚｏｌ總ＲＮＡ提取試劑盒購自上海生工公司，Ｑｕａｎｔ－ｓｃｒｉｐｔｃＤＮＡ合成試劑盒、ＲｅａｌＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ）試劑盒購自天根公司。Ｓｍａｄ７和內參ＧＡＰ－ＤＨ基因引物委托上海生工合成。
１．２實驗方法
１．２．１ＰＣ１２細胞培養及神經元轉化含１０％馬血清及１５％胎牛血清的高糖ＤＭＥＭ培養基常規培養ＰＣ１２細胞，２－３天換液后，當細胞接近８０％融合時，胰酶消化傳代。細胞貼壁后加入終濃度為５０ｎｇ／ｍｌ的ＮＧＦ，連續刺激７天以誘導細胞神經元樣轉化。
１．２．２氧糖剝奪模型的建立 神經元樣ＰＣ１２細胞經含有１０％胎牛血清和１．０ｍｏｌ／ＬＮａ２Ｓ２Ｏ４的無糖ＤＭＥＭ培 養 液 培 養１６ｈ，建 立ＯＧＤ１６ｈ組。
１．２．３大鼠Ｓｍａｄ７基因的ｓｉＲＮＡ合成設計大鼠Ｓｍａｄ７基因的ｓｉＲＮＡ，正義 鏈５’－ａａｃｇａｕｃｕｇｃｇｃｕｃｇｕｃｃｇｇｃｇｕｄｔｄｔ－３’； 反 義 鏈３’－ｄｔｄｔｕｕｇｃ－ｕａｇａｃｇｃｇａｇｃａｇｇｃｃｇｃａ－５’。ＳｉＲＮＡ及陰性對照基因序列委托吉凱生物有限公司合成。
１．２．４ｓｉＲＮＡ轉染及分組２４孔板內細胞８０％融合時行轉染，于前一天將培養液更換為不含血清及抗生素的高糖ＤＭＥＭ，分別轉染靶向Ｓｍａｄ７基因的ｓｉＲＮＡ，陰性ｓｉＲＮＡ及對照ＰＢＳ，建立陽性轉染組，陰性轉染組及空轉染組，轉染濃度５０ｎＭ，２４ｈ后行ＯＧＤ１６ｈ。
１．２．５Ｓｍａｄ７基因ｍＲＮＡ的表達檢測收集細胞，Ｔｒｉｚｏｌ法提取總ＲＮＡ，逆轉錄為ｃＤＮＡ。應用ＡＢＩ７５００Ｆａｓｔ型實時熒光定量ＰＣＲ儀對Ｓｍａｄ７基因及內參ＧＡＰＤＨｍＲＮＡ的表達進行檢測。引物序 列 如 下：Ｓｍａｄ７上 游５＇－ＴＣＣＴＧＣＴＧＴＧ－ＣＡＡＡＧＴＧＴＴＣ－３＇，下 游５＇－ＡＧＴＡＡＧＧＡＧ－ＧＡＧＧＧＧＧＡＧＡＣ－３＇，片 段大?。海保埃矗猓?；ＧＡＰＤＨ上游５＇－ＧＧＴＴＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴ－３＇，下游５＇－ＡＴＧＧＧＴＴＴＣＣＣＧＴＴＧＡＴＧＡＣ－３＇，片 段 大 ?。海保罚保猓?。結果應用ＲｅｌａｔｉｖｅＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ｄｄＣｔ）Ｓｔｕｄｙ軟件行相對定量分析。檢測實驗重復三次。
１．２．６ＭＴＴ細胞存活率檢測
三組細胞以１×１０４個／孔接種于９６孔板，每組１０個復孔，各組隨機選擇５個復孔行ＯＧＤ１６ｈ，每孔加人２０μｌ的ＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）３７℃孵育４ｈ后棄去培養液，加入２００μｌ的二甲基亞砜溶解藍紫色結晶，充分振蕩溶解，應用酶標儀在４９０ｎｍ激發波長測吸光度（Ａ）。ＯＧＤ１６ｈ的Ａ值與ＯＧＤ０ｈ的Ａ值比較，計算每組細胞存活率。檢測實驗重復三次。
１．２．７Ｓｍａｄ７和ＡｃｔＡ的蛋白水平檢測
神經元樣ＰＣ１２細胞，經ＯＧＤ１６ｈ處理的陽性及陰性轉染組細胞分別消化離心，利用含有１％ ＰＭＳＦ的ＲＩ－ＰＡ裂解提取總蛋白，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳，轉膜，封閉，而后分別用兔抗大鼠Ｓｍａｄ７（１∶５００）和ＡｃｔＡ（１∶５００）一抗４℃過夜孵育，洗膜，羊抗兔二抗（１∶５００）３７℃孵育２ｈ，ＥＣＬ顯影壓膠片。
１．３統計學分析
應用ＳＰＳＳ１０．０軟件包，計量資料用ｘ珚±ｓ描述，均數間比較采用獨立樣本ｔ檢驗，多個均數比較采用單因素方差分析，Ｐ＜０．０５視為有統計學意義。
２結果
２．１Ｓｍａｄ７ｓｉＲＮＡ沉默效果檢測
應用ＲｅａｌＴｉｍｅＲＴ－ＰＣＲ檢測Ｓｍａｄ７ｍＲＮＡ的表達變化，陽性轉染組Ｓｍａｄ７ｍＲＮＡ表達水平（０．３２±０．１３）較陰性轉染組顯著下調（０．６８±０．１４）（見圖１）。２．２Ｓｍａｄ７及ＡｃｔＡ蛋白水平的表達檢測
ｓｉＲＮＡ轉染２４ｈ，Ｓｍａｄ７及ＡｃｔＡ蛋白表達檢測顯示：ＯＧＤ１６ｈ，ｓｉＲＮＡ陽性轉染組Ｓｍａｄ７蛋白表達（０．３５±０．０８）與陰性組（１．１７±０．１２）比較，顯著下調。ＯＧＤ后ＡｃｔＡ蛋白表達上調，以陽性轉染組 為 著 （對 照 組：０．９４±０．１０，陰 性 轉 染 組＋ＯＧＤ１６ｈ：１．２９±０．１３，陽性轉染組＋ＯＧＤ１６ｈ：２．４６±０．１６）（見圖２）。２．３細胞存活率ＭＴＴ檢測
ＯＧＤ１６ｈ后ＭＴＴ細胞存活率檢測結果顯示：陽性轉染組（９０．６８％±１．３１％）與陰性轉染組（８０．５６％±２．１３％）及空轉染組相比（７８．３％±１．７２％），存活細胞比例顯著升高（見圖３）。
３討論
國內外研究及本課題組的前期工作均證實ＡｃｔＡ的抗缺血損傷神經保護作用。目前研究表明，其信號轉導機制主要為Ｓｍａｄｓ家族蛋白將胞外信號傳遞至胞內繼而調控核內基因的表達。在該通路信號轉導過程中，Ｓｍａｄｓ蛋白作為重要結點，一方面，膜受體激活的Ｓｍａｄｓ２／３和通用Ｓｍａｄｓ（ｃｏｍｍｏｎｍｅｄｉａｔｏｒＳｍａｄｓ，Ｃｏ－Ｓｍａｄｓ）作為信號轉導通路的細胞內傳遞因子發揮著級聯反應功能，另一方面通過抑制性Ｓｍａｄｓ（Ｓｍａｄ６／７），抑制該通路的激活 過程。在非神經細胞模型的研究中，Ｓｍａｄ７主要通過與抑制性Ｓｍａｄｓ競爭結合ＴＧＦ－βＩ型受體以及促進ＴＧＦ－βＩ型受體去磷酸化而發揮負性調節作用。但Ｓｍａｄ７基因對神經細胞缺血性損傷及其相關的ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ通路活化的影響目前尚不明確。為此，本研究利用ＲＮＡ干擾技術，體外設計合成靶向大鼠Ｓｍａｄ７基因的ｓｉＲＮＡ，通過脂質體轉染技術，瞬時轉染神經元樣ＰＣ１２細胞，繼而對Ｓｍａｄ７在轉錄及蛋白水平的表達、細胞對ＯＧＤ損傷的敏感性及ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ通路的活化水平進行研究。
結果發現，ＰＣ１２細胞經外源性ｓｉＲＮＡ瞬時轉染后，經實時定量ＰＣＲ及蛋白印記檢測均證實細胞內Ｓｍａｄ７基因在ｍＲＮＡ及蛋白水平的表達均明顯下調，細胞ＯＧＤ損傷后的存活率升高，與陰性轉染組及空轉染組相比有顯著差異。
本研究進一步對ＡｃｔＡ蛋白的表達情況進行了檢測，以明確ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ通路的活化水平，結果顯示ＯＧＤ損傷刺激激活了調細胞內初級ＡｃｔＡ蛋白合成，且此過程受Ｓｍａｄ７基因的負向調節?？紤]到細胞外ＡｃｔＡ是該信號通路的始動因素，目前研究結果提示了ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ通路活化可能存在著一定程度的環路（反饋）調節，在ＯＧＤ損傷過程中通過正反饋促進ＡｃｔＡ基因表達，維持通路活性，但該機制又受到Ｓｍａｄ７基因的負性調控，其途徑一方面可能是通過經典機制下調通路活化程度，另一方面可能也與Ｓｍａｄ７可以結合核內ＤＮＡ，干擾可發揮生物 學 功 能 性 的Ｓｍａｄｓ－ＤＮＡ復合物形成有關。但Ｓｍａｄ７對ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ通路調控的確切機制仍有待于在時間水平上對神經細胞缺血損傷這一動態過程中不同時間位點以及空間水平上在細胞核內的進一步探討和研究。
參考文獻：
［１］ＭａｓｓａｇｕéＪ，ＳｅｏａｎｅＪ，ＷｏｔｔｏｎＤ．Ｓｍａｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．ＧｅｎｅｓＤｅｖ，２００５，１９（２３）：２７８３．
［２］ＳｃｈｕｂｅｒｔＤ，ＫｉｍｕｒａＨ，ＬａＣｏｒｂｉｅｒｅＭ，ｅｔａｌ．Ａｃｔｉｖｉｎｉｓａｎｅｒｖｅｃｅｌｌｓｕｒｖｉｖａｌｍｏｌｅｃｕｌｅ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４４（６２６９）：８６８．
［３］ＨｅＪｉｎ－Ｔｉｎｇ，ＭａｎｇＪｉｎｇ，ＭｅｉＣｈｕｎ－Ｌｉ，ｅｔａｌ．ＮｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅＥｆｆｅｃｔｓｏｆＥｘｏｇｅｎｏｕｓＡｃｔｉｖｉｎＡｏｎＯｘｙｇｅｎ－ＧｌｕｃｏｓｅＤｅｐｒｉｖａｔｉｏｎｉｎＰＣ１２Ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１１，１７（１）：３１５．
［４］ＭｕｋｅｒｊｉＳＳ，ＲａｉｎｅｙＲＮ，ＲｈｏｄｅｓＪＬ，ｅｔａｌ．ＤｅｌａｙｅｄａｃｔｉｖｉＡａｄ－ｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎａｔｔｅｎｕａｔｅｓｔｉｓｓｕｅｄｅａｔｈａｆｔｅｒｔｒａｎｓｉｅｎｔｆｏｃａｌｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａａｎｄｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｔｒｅｓｓ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪＮｅｕｒｏｃｈｅｍ，２００９，１１１（５）：１１３８．
［５］ＳｃｈｍｉｅｒｅｒＢ，ＨｉｌｌＣＳ．ＴＧＦｂｅｔａ－ＳＭＡＤｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：ｍｏ－ｌｅｃｕｌａｒｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ［Ｊ］．ＮａｔＲｅｖＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ，２００７，８（１２）：９７０．
［６］ＭｕｋｅｒｊｉＳＳ，ＫａｔｓｍａｎＥＡ，ＷｉｌｂｅｒＣ，ｅｔａｌ．Ａｃｔｉｖｉｎｉｓａｎｅｕｒｏｎａｌｓｕｒｖｉｖａｌｆａｃｔｏｒｔｈａｔｉｓｒａｐｉｄｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄａｆｔｅｒｔｒａｎｓｉｅｎｔｃｅｒｅｂｒａｌｉｓ－ｃｈｅｍｉａａｎｄｈｙｐｏｘｉａｉｎｍｉｃｅ［Ｊ］．ＪＣｅｒｅｂＢｌｏｏｄＦｌｏｗＭｅｔａｂ，２００７，２７（６）：１１６１
［７］ＫａｔｏＳ，ＵｅｄａＳ，ＴａｍａｋｉＫ，ｅｔａｌ．ＣｔｏｐｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳｍａｄ７ｉｎｈ－ｈｉｂｉｔｓｔｒａｎｓ－ｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＬｉｆｅＳｃｉ，２００１，６９（２２）：２６４１．［８］ＥｂｉｓａｗａＴ，ＦｕｋｕｃｈｉＭ，ＭｕｒａｋａｍｉＧ，ｅｔａｌ．Ｓｍｕｒｆ１ｉｎｔｅｒａｃｔｓｗｉｔｈｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａｔｙｐｅＩｒｅｃｅｐｔｏｒｔｈｒｏｕｇｈＳｍａｄ７ａｎｄｉｎｄｕｃｅｓｒｅｃｅｐｔｏｒｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００１，２７６：１２４７７．
［９］ＺｈａｎｇＳ，ＦｅｉＴ，ＺｈａｎｇＬ，ｅｔａｌ．Ｓｍａｄ７ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓＴＧＦ－βｓｉｇｎａ－ｌｉｎｇｉｎｔｈｅｎｕｃｌｅｕｓｂｙｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇｗｉｔｈｆｕｎｃｔｉｏｎａｌＳｍａｄ－ＤＮＡｃｏｍｐｌｅｘｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＭＣＢ，２００７，２７（１２）：４４８８
