前言由于大鼠肝臟各葉彼此分開，各葉肝蒂游離于肝外，肝葉比重相對固定，方便進行各種比例的肝部分切除。肝部分切除模型主要應用于肝臟腫瘤、肝再生、急慢性肝衰竭以及肝移植等模型的研究。理想的急性肝衰竭動物應具有①可逆性：肝衰竭有潛在的可逆性，適當的方法可以治療并能長期存活；②可重復性：肝損傷模型的制備可以重復，并應具有相同的病死率和較相似的指標；③死于肝衰竭：肝損傷動物模型最終應死于肝衰竭；④治療窗口期：由發生肝衰竭到死亡應具有足夠的時間，以進行適當的治療；⑤大型動物；⑥對環境和實驗人員危害最小。隨著干細胞治療肝損傷及護肝藥物研究的發展，對大鼠肝損傷模型也提出了很多新的要求。本實驗擬在肝部分切除術的基礎上對模型鼠進行改進，并行細胞移植實驗，對比分析新模型的優劣。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 F344 大鼠 由上海 Slack 實驗動物中心提供，由第四軍醫大學動物中心實驗動物房飼養。
1.1.2 材料 動物手術臺、手術顯微鏡（OPMI，德國）、高頻電刀、無損傷血管夾、小兒硬膜外導管（內徑約 0 .7 mm），止血鉗等常規手術器械、肝素鈉、鹽水、全自動生化分析儀\\(日立 7170型，日本\\)。第三代構建 GFP 示蹤的胎肝干細胞（本課題組三步分離法制備），20 % 胎牛血清\\(Hyclone，USA\\)，胰蛋白酶（Gib-co 公司，USA），Williams’E 培養基（Sigma 公司 USA\\)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 ⑴一次性硬膜外導管制備測孔，并用 50 U/ml肝素鈉注射液肝素化。大鼠術前禁食 12 小時、禁水 4 小時。10%水合氯醛\\(3 ml/kg\\)腹腔內注射麻醉，將麻醉后固定于實驗臺上，備皮、消毒, ⑵60 只大鼠分為三組，A 組：對照組；B 組：經門靜脈途徑注射治療組；C 組：經肝斷面門靜脈分支殘端置管治療組。取上腹部劍突下正中切口, 長約 5 cm，進入腹腔，A、B組大鼠依次行 85 %肝切除術（切除肝左外葉、肝中葉、右上葉，保留右下葉、尾葉）。C 組大鼠找到進入肝左外葉 Glisson 鞘系統的門靜脈，用無損傷血管夾分別夾閉其近心端和遠心端，3-0 絲線結扎肝葉靜脈后，向肝左外葉方向完全游離長約 1 cm左右的血管，血管下穿過兩根 3-0 絲線。靜脈全層剪一“V”形小口，將硬膜外導管沿切口緩慢送入靜脈；輕輕放開近心端血管夾，將導管方向向下置入 2 cm，回抽有血后固定，結扎 Glisson鞘，切斷肝左外葉，切除肝中葉、右上葉。導管固定腹壁沿皮下自頸后部穿出，連接接頭、肝素帽。
1.2.2 干細胞植入及肝功能檢查 術中 B 組即經門靜脈穿刺注入 4×105個表達 GFP 的胎肝干細胞（FLSPCs）。C 組經留置管注射入同等量的 FLSPCs，A 組經門靜脈注射同等劑量的培養液。72 小時取血測定肝功能 ALT、AST，統計死亡率；取肝臟組織切片觀察其修復情況。熒光顯微鏡下觀察胎肝干細胞定植情況。
1.2.3 術后維護 術后三組大鼠飼養于 18-22 ℃環境中，飲水使用 5 %葡萄糖溶液，以普通條狀塊料喂養，腹腔注射青霉素 4萬單位，2 次 / 日。C 組大鼠放入單籠喂養，保溫至其蘇醒。每日推注 0.5 mL 肝素鹽水（25 U /ml）封管，可保持管道通暢。

1.3 統計學方法

應用 SPSS 17.0 統計軟件進行分析，數據以\\(x±s\\)表示。組間均數比較采用方差分析和 LSD-t 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況以及肝功能的影響

三組大鼠均于造模后 12 小時開始出現精神萎靡、拒食，少動，嗜睡、小便失禁、共濟失調。12 小時開始出現死亡，48 小時到達高峰。死亡率分別為：A 組 70 %（14/20）、B 組 40 %（8/20）、C 組 45 %（9/20）。術后 C 組 2 只大鼠因導管脫出導致出血死亡。移植干細胞 72 小時后組間肝功能 A 組與 B、C 組 ALT、AST 出現統計學差異，B、C 組肝功恢復較 A 組明顯。B、C 組間無明顯統計學差異。2.2 胚胎肝干細胞移植對肝臟病理的影響

胎肝干細胞移植 72 小時后，取出大鼠肝臟，肉眼觀 A 組剩余肝葉代償性腫大。鏡下可見肝竇及中央靜脈擴張，伴有炎細胞浸潤，肝細胞增生不明顯；B、C 組見肝臟體積較對照組有所增大，肝葉代償，鏡下見肝細胞增生明顯，肝索結構較完整，肝小葉結構較 A 組有較明顯恢復。熒光顯微鏡下可見 B 組、C組表達 GFP 的胎肝干細胞大量定植于肝葉組織中的密度大致相同（圖 1、2）。3 討論

大鼠為常用的實驗動物，隨著肝臟藥物及細胞治療急性肝損傷研究的發展，以其為實驗動物時許多研究均需通過靜脈持續、反復、不同時間點的給藥、測定檢驗指標。鼠尾靜脈便于穿刺，但是易擺動，穿刺針不易固定，且僅適于單次操作。并且在手術制備急性肝損傷模型過程中常常失血量較大，其中僅切除肝葉內儲存的血量丟失就足以使循環血量銳減，加之術后動物不能立即恢復飲水進食，常導致其休克、脫水、低血糖引起非肝功能因素死亡。因此術中、術后輸液尤為重要?；谝陨显?，靜脈置管成為首選的方法。傳統的靜脈置管方法均在原有肝臟切除的基礎上另取部位進行手術置管，如頸內靜脈、腹股溝靜脈甚至門靜脈屬支置管，需在已制備急性肝損傷大鼠手術基礎上另附加不同部位的手術創傷、耗時、費力。本實驗采用價廉、易得的材料，在大鼠已切除肝葉的肝斷面門靜脈分支殘端置管、固定，建立一可靠、相對經濟的實驗大鼠靜脈通路。
大鼠肝葉分為 6 葉，各葉均有相對獨立的 Glisson 鞘系統及肝靜脈回流系統，易于繞線阻斷血流，Glisson 鞘中均有較粗的門靜脈分支，容易分離進行靜脈置管等操作。在置管操作過程中應注意一下幾點：①保持靜脈充盈，血管應先阻斷近端，再阻斷遠端；②用 2 %利多卡因滴于靜脈表面浸潤，防止因剝離或放線等操作引起血管痙攣；③阻斷血流后應往備切除的肝葉方向盡可能的多分離血管，方便插管操作，保證插管深度，不致術后脫出；④插管后不宜過深，防止管道進入門靜脈主干或其他肝葉的門脈屬支，引起血流障礙或門靜脈高壓；⑤導管需潛行皮下，自頸背部引出，術后單籠飼養，防止撕咬致導管脫出。
移植部位的不同直接影響到移植細胞的歸巢和治療效果。腹腔移植細胞存活率低下，外周靜脈注射藥物或細胞，最終到達肝臟均有不同程度的劑量減少。門靜脈提供 70%以上的肝臟血液供應，到達干細胞血竇后留置時間較長，選擇性分布良好，在不改變器官微結構的情況下與肝實質融合。經門靜脈移植細胞途徑已被認同在細胞移植的途徑中具有高濃度、少不良反應、利于細胞遷移定植的優點，其更符合生理學和組織學的特點，且門脈系統內含有高濃度的嗜肝細胞因子，肝臟本身的微環境及門靜脈血中的營養成份均對植入的細胞也有益。肝臟的靶向性用藥也可提高療效，減少用藥劑量，降低治療成本以及藥物的不良反應。本實驗中應用相同量的胎肝干細胞對不同模型的急性肝衰竭大鼠的治療過程中發現對肝功能、凝血功能的糾正以及對肝臟修復能力，經肝斷面門靜脈分支殘端置管途徑效果等同于經門靜脈穿刺給藥，同時相對于門靜脈穿刺給藥途徑，本模型還具有可反復、多次、選時以及補液治療等優點，并避免了門脈穿刺過程中出血、血栓形成，同時易于控制給藥速度，防止門靜脈高壓的產生阻礙受體肝臟血流等缺點。

參 考 文 獻（References）
[1] Aalbers AGJ, Kate M, Grevenstein WMU, et al. A small mammalmodel of tumour implantation, dissemination and growth factorexpression after partial hepatectomy [J]. Eur J Surg Oncol, 2008, 34\\(4\\): 469-475
[2] Li CX, Shao Y, Ng KT, et al. FTY720 suppresses liver tumormetastasis by reducing the population of circulating endothelialprogenitor cells[J]. PLoS One, 2012, 7\\(2\\): 32380
[3] Piscaglia AC, Shupe TD, Pani G, et al. Establishment of cancer celllines from rat hepatocholangiocarcinoma and assessment of the roleof granulocyte-colony stimulating factor and hepatocyte growth factorin their growth, motility and survival[J]. J Hepatol, 2009, 51\\(1\\): 77-92
[4] de Graaf W, Bennink RJ, Heger M, et al. Quantitative assessment ofhepatic function during liver regeneration in a standardized rat model[J]. J Nucl Med, 2011, 52\\(2\\): 294-302
[5] Ren YS, Qian NS, Tang Y, et al. Beneficial effects of splenectomy onliver regeneration in a rat model of massive hepatectomy [J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2012, 11\\(1\\): 60-65
[6] Sanchez-Hidalgo JM, Naranjo A, Ciria R, et al. Impact of age on liverregeneration response to indury after partial hepatectomy in a ratmodel[J]. J Surg Res, 2012, 175\\(1\\): el-e9
[7] Sun CK, Chen CH, Kao YH, et al. Bone marrow cells reducefibrogenesis and enhance regeneration in fibrotic rat liver [J]. J SurgRes, 2011,169\\(1\\): 15-26
[8] Ishibe A, Togo S, Kumamoto T, et al. Prostaglandin E1 prevents liverfailure after excessive hepatectomy in the rat by up-regulating CyclinC, Cyclin D1, and Bclxl[J]. Wound Repair Regen, 2009, 17\\(1\\): 62-70
[9] Ninomiya M, Shirabe K, Terashi T, et al. Deceleration of regenerativeresponse improves the outcome of rat with massive hepatectomy[J].Am J Transplant, 2010, 10\\(7\\): 1580-1587
[10] 劉文淵, 張玉君, 徐土炳, 等. 離體肝切除聯合自體肝移植大鼠模型的建立[J]. 山西醫科大學學報, 2011, 42\\(9\\): 703-705Liu Wen-yuan, Zhang Yu-jun, Xu Tu-bing, et al. Establishment of anextracorporeal liver resection and partial liver autotransplantationmodel in rats[J]. J Shanxi Med Univ, 2011, 42\\(9\\): 703-705
[11] Benjamin M, Stutchfield, Stuart J, et al. Prospects for stem celltransplantation in the treatment of hepatic disease [J]. Liver Transpl,2010, 16\\(7\\): 827-836
[12] Lazarevich NL, Shavochkina DA, Fleishman DI, et al. Deregulationof hepatocyte nuclear factor 4\\(HNF4\\) as a marker of epithelial tumorsprogression[J]. Exp Oncol, 2010, 32\\(3\\): 167-171
[13] 史冀華, 朱盛興, 張水軍. 大鼠肝部分切除術的應用解剖及實施[J].世界華人消化雜志, 2008, 16\\(22\\): 2516-2520Shi Ji-hua, Zhu Sheng-xing, Zhang Shui-jun. Applied Anatomy ofliver and partial hepatectomy in rats[J]. World Chin J Digestol, 2008,16\\(22\\): 2516-2520
[14] Aller MA, Lorente L, Prieto I, et al. Hepatectomies in the rat: A lookat the caudate process through microsurgery [J]. Dig Liver Dis, 2009,41\\(10\\): 695-699
[15] Palmes D, Dietal KH, Derw G, et al. Auxiliary Partial orthotopic livertransplantation treatment of acute liver failure in an new rat model[J].Langenbecks Arch Surg, 2002, 386\\(7\\): 534-541
[16] Madrahimov N, Dirsch O, Broelsch C, et al. Marginal hepatectomy inthe rat:from anatomy to surgery[J]. Ann Surg, 2006, 244\\(1\\): 89-98
[17] Petersen BE, Bowen WC, Patrene KD, et a1. Bone l11ar.FOW as apotential source of hepatic oval cells [J]. Science, 1999, 284 \\(14\\):1168-1170
[18] 馬軍, 段芳齡, 李文晰, 等. 大鼠移植骨髓細胞向肝細胞轉化的實驗研究[J]. 胃腸病學和肝病學雜志, 2003, 12\\(2\\): 138-143Ma Jun, Duan Fang-ling, Li Wen-xi, et al. Study on differentiation ofbone marrow cells into hepatic lineages in rat[J]. Chin J Gastro Hepa,2003, 12\\(2\\): 138-143
[19] 向國安, 張剛慶, 方馳華, 等. 同種異體骨髓間質干細胞移植在大鼠肝內定居能力初步研究 [J]. 第一軍醫大學學報, 2005, 25\\(8\\):994-997Xiang Guo-an, Zhang Gang-qing, Fang Chi-hua, et al. A preliminarystudy of the homing capacity of allograft mesenchymal stem cells torat liver[J]. J First Mil Med Univ, 2005, 25\\(8\\): 994-997
[20] 劉彥, 譚道玉, 李昌平, 等. 細胞移植對肝纖維化大鼠肝臟組織結構的影響[J]. 檢驗醫學與臨床, 2009,12\\(6\\): 933-935Liu Yan, Tan Dao-yu, Li Chang-ping, et al. Effect of transplantinghepatocyte-like cells on rat's hepatic histologic structure r [J]. LabMed Clin, 2009,12\\(6\\): 933-935[21] Eguchi S, Lilja H, Hewitt WR, et a1. Loss and recovery of liveregeneration in rats with fulminant hepatic failure [J]. J Stag Res,1997, 72\\(2\\): 112-122