多氯聯苯 （polychorinated biphenyls，PCBs） 是一種全球性環境污染物，對生物體可產生嚴重的毒害作用，尤其是對發育過程中的胎兒更為敏感，可導致運動失調、腦損傷、發育遲緩、智商降低等神經毒性．PCBs 的神經毒性機制尚不清楚，可能通過調節基因表達而產生毒副作用．Neuronatin（Nna）t 是一種與腦細胞的發育和分化密切相關的基因，在胎兒期和幼年期腦發育最旺盛時高表達，而成人后表達量逐漸下調，其錯誤表達將導致大腦發育障礙的發生．PCBs 是否通過下調 Nnat 基因的表達，而影響胎兒神經系統的發育，本研究通過多氯聯苯 Aroclor 1254 （A1254） 作用于胎鼠神經干細胞 （Neural stem cells， NSCs） 而探討其作用機制．

1、 材料與方法

1.1 動物和主要試劑

SD 孕鼠來自廣州中醫藥大學動物實驗中心，DMEM/F12、B27、EGF、bFGF 購自 Gibco 公司，胎牛血清購自杭州四季青公司， Nestin、Nnat 和β-actin 單克隆抗體購自 Abcam 公司，A1254 購自Sigma 公司，AxyPrep 總 RNA 小量制備試劑盒購自Axygen 公司，引物由上海生物工程技術服務有限公司合成，Annexin V-FITC/kit 細胞凋亡檢測試劑盒購自 Caltag Laboratoyies 公司．

1.2 方法

1.2.1 胎鼠 NSC 的分離、培養 孕 12～14 d SD大鼠，頸椎脫臼處死．無菌條件下打開腹腔，取出胎鼠解剖腦組織，剪碎吹打制成單細胞懸液．加入含 B27 5 mL/L，EGF 20 μg/L，bFGF 20 μg/L，青霉素和鏈霉素 100 U/mL 的 DMEM/F12 無血清培養基中．將原代細胞 2×105個細胞 /mL 接種于 25cm2培養瓶中，置于 37 ℃、5%CO2培養箱中常規培養，每 5～7 d 傳代 1 次．1.2.2 胎鼠 NSC 的鑒定 將單細胞懸液種植于培養皿中，置入多聚賴氨酸包被的玻片，分別用無血清培養基 （DMEM/F12/B27/bFGF/EGF） 和含血清培養基 （DMEM/F12+5%胎牛血清） 培養，觀察其生長分化情況，分別于 12 h、2 d、7 d、14 d 進行Nestin 免疫熒光染色檢測．玻片取出后 PBS 洗 3 次；4％多聚甲醛固定20～30 min，PBS 洗 3 次；0.2％Triton X-100 透化5 min，PBS 洗 3 次；5％BSA 室溫封閉 30 min，加Nestin 單克隆抗體放在濕盒中 4℃過夜，PBS 再洗3 次；加 FITC- 兔抗鼠 IgG 二抗室溫 30 min（注意避光），PBS 洗 3 次；95％甘油封片，然后放在熒光顯微鏡下觀察．1.2.3 A1254 對 NSC 的 處 理 A1254 溶 解 于DMSO 中，將 NSC 細胞隨機分成正?？瞻讓φ战M、溶劑對照組 （培養基中 DMSO 濃度為 0.1%） 和 3組實驗組 （培養基中 A1254 終濃度分別為 0.10ng/mL、1.00 ng/mL、10.00 ng/mL） ．處理 72 h 后離心處理細胞備用．1.2.4 實時定量 RT-PCR AxyPrep 總 RNA 小量制備試劑盒提取總 RNA，用隨機六聚體反轉錄合成 cDNA，擴增 Nnat 基因．Nnat 上游引物 5'TCCGGA ATT CAT GCT CCA CGA GTC CTA CTG 3'，下游引物 5'ACG CGT CGA CAA ACT CTG AGT CTGGAC AAC 3'，擴增產物為 260 bp；內參照 G3PDH上游引物 5'TGC CAC TCA GAA GAC TGT GG 3'，下游引物 5'CAA CGG ATA CAT TGG GGG TA 3'，PCR產物為 182 bp．反應體系為 25 μL，反應條件 94℃變性 30 s、58 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 30 s，30次循環后 72 ℃ 5 min 延長．1.2.5 Western blot 收集細胞用 PBS 洗 3 次，加SDS 蛋白裂解液放置在冰上裂解 30 min．轉移至EP 管中，12 000 g×15 min 4℃，提取各組總蛋白，Bradford 的方法測定蛋白的含量．取 50 ug 樣品，進行 SDS-PAGE 電泳分離；半干式電轉到醋酸纖維素膜上，用含 5％脫脂奶粉室溫封閉 1 h；加入Nnat 和 β-actin 抗體，4 ℃下孵育過夜；TBS 洗膜后與辣根過氧化物酶標記的 IgG 二抗室溫孵育1h．洗膜后以化學發光法檢測蛋白表達量．曝光底片應用凝膠成像系統進行掃描，用 Fluorchem 1.02軟件對條帶的灰度進行半定量分析，結果用目的蛋白的光密度與內參照的光密度的相對值來比較．1.2.6 細胞凋亡 用 PBS 洗滌 2 次細胞后，用稀釋的結合緩沖液重懸為（2～5）×105/mL，195 μL細胞懸液加入 5 μL Annexin V-FITC 混勻，室溫避光孵育 10 min，PBS 洗滌 1 次，再用 190 μL 結合緩沖液重懸，加入 10 μL PI，流式細胞儀檢測．
1.3 統計學處理。

計量資料以均數±標準差 （x±s） 表示，應用SPSS 統計軟件進行方差齊性檢驗、方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義.

2、 結果

2.1 胎鼠 NSC 的培養、鑒定

原代細胞呈圓形球狀，懸浮生長，2～3 d 后可見大小不等的細胞團，較大者由數十個細胞組成．細胞形態規則，邊界清楚，折光性強 （圖 1 A） ．7 d 后可見由數百個細胞組成的細胞團，呈桑椹狀．經添加 5%胎牛血清誘導 24 h 后，即可見到細胞團貼壁，各種不同形態的細胞從細胞團中長出，2～3 d 后可見大部分細胞貼壁生長，突起不斷增粗和伸長，1 周后分化成大量形態不一的、分散成片的多突起星狀細胞和神經元樣細胞，突起互相交織成網狀，表現出明顯的神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞的形態特征 （圖 1 B） ．2 周后部分神經細胞開始衰退、死亡．經含血清培養基培養 12 h、2 d、7 d、14 d 行Nestin 免疫熒光染色，12 h 和 2 d 時可見較多Nestin 陽性細胞，在熒光顯微鏡下呈現黃綠色熒光（圖 1 C），在 7 d 時尚可見部分 Nestin 陽性細胞，2周時幾乎未找到 Nestin 陽性細胞．A1254 對 NSC Nnat mRNA 表達的影響 （圖2） ．Nnat mRNA 的表達，0.10 ng/mL 組與對照組和溶劑對照組比較有所下降，差異無統計學意義（P＞0.05）；1.00 ng/mL 組和 10.00 ng/mL 組均較空白對照組和溶劑對照組下降，差異有顯著性 （P＜0.05） ．提示隨著 A1254 濃度升高，Nnat 基因表達下降 （表 1） ．A1254 對 NSC Nnat 蛋 白 表 達 的 影 響 （圖3） ．Nnat 蛋白質的表達，0.10 ng/mL 組與對照組和溶劑對照組比較有下降，但無統計學差異 （P＞0.05）；而 1.00 ng/mL 組和 10.00 ng/mL 組均較空白對照組和溶劑對照組下降，差異有統計學意義（P＜0.05） ．提示隨著 A1254 濃度升高，Nnat 基因表達下降 （表 1） .

2.2 A1254 對 NSC 細胞凋亡的影響

A1254 染毒實驗中，1.00 ng/mL 組和 10.00ng/mL 組中，NSC 細胞凋亡增加，與對照組和溶劑對照組比較差異有統計學意義 （P＜0.05），提示隨著 A1254 劑量的增加，NSC 凋亡逐漸增多 （表1） .

3、 討論

巢蛋白 Nestin 是胚胎中樞神經系統祖細胞的主要中間纖維蛋白，在大腦發育過程中高表達，在大腦發育成熟后表達量急劇下降，常常作為神經干細胞的特征性標志物．本實驗中，神經干細胞培養液中所培養的原代細胞細胞 Nestin 表達陽性，免疫熒光染色后在熒光顯微鏡下呈黃綠色熒光．隨著添加 5％胎牛血清誘導分化后表達量下降，甚至不表達．表現為含血清培養基培養 7 d 的Nestin 陽性細胞將少，培養 14 d 的 Nestin 陽性細胞消失．添加血清 24 h 后逐漸分化，出現神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞的形態特征，該細胞具有多向分化的潛能．以上結果說明所培養的原代細胞為神經干細胞．目前環境污染已成為一個全球性問題，其中PCBs 是首批被 《斯德哥爾摩公約》 列入全球控制的 12 種持久性有機污染物之一，如今地球生物圈的任何地方包括地球兩極和珠穆朗瑪峰都有 PCBs的蹤跡．我們日常的生活環境中，已經不可能完全隔絕 PCBs 污染的毒副作用．由于兒童處于組織器官生長發育的旺盛期，尤其是胎兒期，因此對環境毒物的毒性特別敏感，對成人無害的暴露劑量常常導致兒童嚴重的發育障礙．PCBs 可導致兒童體格、神經系統、內分泌系統、生殖系統等發育延遲．PCBs 具有高脂溶性，可通過胎盤和乳汁進入胎兒或嬰兒體內．腦組織由于富含脂類而成為 PCBs 攻擊的靶器官，研究表明極低濃度的PCBs （3 μg/kg 體重） 就能阻礙大腦發育的蛋白質合成．PCBs 的神經毒性機制可能包括：活性氧的產生、突觸長時間增強效應的減低、細胞內信號傳遞和乙酰膽堿脂酶活性的改變等．PCBs 也可通過改變印記基因的表達狀態，而抑制胎兒的生長發育．Nnat 基因作為一種高度保守的印記基因，與胎兒神經細胞的發育密切相關，可能作為大腦發育過程中離子通道的調節因子，并與神經系統的成熟或維持，以及空間位置和時間相關．A1254 是一種氯含量為 54％的常見 PCBs 混合物，分子量為 328.4．本研究發現，A1254 可下調Nnat mRNA 和蛋白質的表達，且隨著作用劑量的增加，下調更加明顯，同時出現 NSC 細胞凋亡的增加，推測 PCBs 可能通過改變 Nnat 基因的表達，從而導致了胎兒神經發育的損傷．PCBs 在全球原來被廣泛用于電力設備、液壓設備和熱交換器等，具有難降解性、生物毒性、生物蓄積性和遠距離遷移性的特點，在環境中存量大、隱匿、易擴散．大劑量 PCBs 急性中毒事件發生率遠沒有小劑量、隱形、慢性 PCBs 中毒常見，對胎兒的損害也更加難于預防和干預．目前兒童出現行為偏差、學習障礙的發病率增加，除外其他因素，是否與環境污染的惡化相關，尤其是妊娠期婦女其體內這類化合物的負荷增加是否有關，出生前 PCBs 暴露在一定程度上可影響嬰兒的運動功能發育和學習能力受損．1979 年臺灣發生了 PCBs 污染米糠油的問題，PCBs 暴露母親所生育的 6 月～2.5 歲兒童，其 Bayley 嬰兒發育量表顯示嬰兒精神運動指數 （MD）I 和心理運動指數（PD）I 都低于對照組兒童；6～7 歲兒童韋氏兒童智力量表比對照組低 5 分．行為異常和學習障礙的孩子常常沒有明顯的神經系統器質性異常，也缺乏相應的臨床生化和影像學改變，其基因表達的異常，尤其是胎兒期表達的改變可能是導致了其神經行為偏差的原因之一．除了防止環境污染、避免接觸以外，我們是否可以對已發生 PCBs暴露的母親，逆轉其基因表達的改變，例如上調Nnat 基因的表達，防止胎兒神經發育損傷的發生．由于 Nnat 基因的表達主要受甲基化的調節，而環境污染物可通過引起表觀遺傳修飾異常而產生毒副作用，因此，筆者下一階段將計劃研究A1254 對基因甲基化的影響，以及 Nnat 基因有無相應的改變．