在離體脊髓橫切片的細胞電生理研究中，除強直刺激背根可在腹角記錄到場電位長時程增強\\(long-term potentiation, LTP\\) 現象外，背根傳入和下行激活這兩條通路也可誘發運動神經元 \\(moto-neuron, MN\\) 興奮性突觸后電位 \\(excitatory postsyn-aptic potential, EPSP\\) 的 LTP，而 MN 突觸傳遞的LTP 現象可能是運動技能學習和記憶的生理機制之一。神經營養因子 -3 也可在 MN 誘發 EPSP 的類似LTP 現象，且 N- 甲基 -D- 門冬氨酸 \\(N-methyl-D-aspartate, NMDA\\) 受體在誘導而非維持中起重要作用。在 LTP 的分析中，一般用 EPSP 的幅度、曲線下面積、最大上升斜率以及上升相起始斜率等參數來定量描述突觸效能的變化。盡管 LTP 所涉及的突觸后受體機制已有大量研究，但遞質與受體作用的受體動力學性質是否改變尚未見研究報道。鑒于分析藥物 - 靶體關系的經時性動態過程，即可進行藥物作用的受體動力學參數測定，本實驗室已據此提出了突觸反應的表觀受體動力學分析方法，即通過分析突觸傳遞過程中遞質與突觸后受體作用的歷時性變化，以探討遞質與受體結合、解離的速率和受體的親和力等受體動力學性質。
因此，本文應用新生大鼠 \\(8~14 d\\) 脊髓切片 MN細胞內記錄技術，觀察同側腹外側索 \\(ipsilateralventrolateral funiculus, iVLF\\) 電刺激誘發的 iVLF-EPSP 在其 LTP \\( 即 iVLF-LTP\\) 過程中受體動力學性質的變化，為進一步研究脊髓 MN 等突觸傳遞的可塑性機制提供新的方法。
1 材料與方法
1.1 動物及脊髓切片制備動物實驗方案經皖南醫學院實驗動物倫理委員會批準。取 8~14 d 齡新生Sprague Dawley \\(SD\\) 大鼠 15 只 \\( 由南京江寧青龍山動物繁殖場提供 \\)，雌雄不拘。按報道方法，經乙醚麻醉后分離出脊髓，用振蕩切片機 \\(Vi-bratome, Technical Products International Inc., USA\\)制備脊髓腰骶膨大部的橫切片 \\(400~500 μm\\) 數片，置室溫 \\(25 °C ± 3 °C\\) 下經 95% O2和 5% CO2混合氣體飽和的人工腦脊液 \\(artificial cerebrospinal fluid,ACSF\\) 中備用。
1.2 細胞內記錄及電刺激用吸管將脊髓切片移入自制的全浸式記錄浴槽，用上下兩個絲網相夾固定，持續灌流經混合氣體飽和的處于室溫下的ACSF。 取 內 充 3 mol/L 乙 酸 鉀、 尖 端 阻 抗 為80~140 MΩ 的微電極，在顯微鏡下對脊髓腹角進行穿刺。記錄到的電信號由 Axoclamp-2B 微電極放大器 \\(Axon Instruments, USA\\) 放 大 后， 經 DigiData1200 轉換接口 \\(Axon\\) 輸入計算機，用 pClamp 7.0軟件 \\(Axon\\) 進行采樣、顯示和貯存。細胞內電流注射由微機觸發，經 DigiData 1200 聯機接口到微電極放大器后，刺激電流由探頭輸出經微電極注入細胞內。iVLF及腹根電刺激，由三通道電刺激器\\(日本光電 \\) 產生的方波脈沖，經隔離器以恒壓模式至同芯雙極刺激電極施加，分別用于激活下行纖維和腹根纖維。通過刺激電極在 iVLF 施加測試刺激 \\( 單脈沖，波寬 0.1~0.3 ms，10 次 /min，10~100 V\\)，在腹角MNs 記錄 EPSP 反應，記錄到穩定的 EPSPs 至少15 min 后，對 iVLF 施加強直刺激 \\(100 Hz，50 脈沖 / 串，波寬 0.4~1.0 ms，共 6 串，串間隔 10 s，電壓強度同測試刺激 \\)，強直刺激后繼續記錄測試刺激 \\( 參數同強直刺激前 \\) 誘導的 iVLF-EPSPs 至少 30 min \\(10 次 /min\\)。
1.3 統計分析方法對記錄到的資料，用 Clamp-fit 10.1 軟 件 \\(Axon Instruments/Molecular Devices,USA\\) 進行實驗數據分析，其中 LTP 判定標準為 ：EPSP 幅度增大到或超過基礎值的 120%、增大的維持時間達 30 min 以上。測 EPSP 幅度時，取 1 min內 10 次記錄的平均值，若 EPSP 上爆發動作電位\\(action potential, AP\\)，則取首次出現的 AP 閾值水平。數據統計分析用 Origin 5.0 軟件 \\(Microcal SoftwareInc., USA\\)，結果以 mean ± SEM 表示，相關性采用直線相關分析，P< 0.05 時認為差異具有顯著性意義。
1.4 受體動力學分析方法按文獻報道方法進行表觀受體動力學分析，即依據突觸反應大小依賴于受體激活數量，受體激活數量又依賴于遞質的釋放量，遞質釋放量則依賴于刺激強度大小的特性，將刺激強度的大小作為起作用的有效遞質濃度高低的表觀指標，將突觸反應幅度大小作為遞質結合突觸后受體量的表觀指標，進行表觀受體動力學分析，此處的 “ 表觀 ” 意為分別使用有效遞質濃度、遞質結合的突觸后受體量的表觀指標進行的受體動力學分析，以區別于直接測定遞質濃度、遞質結合受體數量的受體動力學分析。具體來說，就是將一定強度電刺激誘發的突觸反應 EPSP 之上升相和下降相，與配體 - 受體的結合動力學過程和解離動力學過程相對應，以 EPSP 的幅度 \\(Veq，EPSP 峰值 \\) 表征遞質與受體的平衡結合濃度，以 EPSP 的不同時間膜電位值 \\(V\\) 表征遞質結合的受體濃度，以電刺激強度 \\(S，以閾刺激強度 T 為單位 \\) 表征有效遞質濃度，再以 K1為表觀結合速率常數、K2為表觀解離速率常數，得 EPSP 上升相和下降相的直線化公式分別為 ：ln[Veq/\\(Veq– V\\)] = \\(K1·S + K2\\)·t 和 ln\\(V/Veq\\) =K2·t，用 EPSP 的實測數據進行直線回歸所得斜率分別為 K1S + K2和 K2。在求得 K2\\( 單位為 ms1\\)和 K1\\( 單位為 T1·ms1\\) 基礎上，再進一步求得表觀平衡解離常數 KT\\( 表征平衡解離常數 KD\\) ：KT= K2/K1\\( 單位為 T\\)，也稱為表觀半幅有效遞質濃度 \\( 表征 EC50\\)。KT代表受體的親和力，KT值越小，說明遞質與受體的親和力越高。
2 結果
記錄到靜息電位負于 60 mV、AP 有超射的細胞后，通過置于腹根的同芯雙極刺激電極對細胞進行逆行鑒定，記錄到 “ 全或無 ” 特點的 AP，即可鑒定為 MN，再進行 iVLF-EPSP 的記錄和下述實驗分析。
2.1 iVLF-EPSP的刺激強度依賴性通過置于 iVLF 的刺激電極進行不同強度 \\( 單脈沖，波寬 0.1~0.3 ms，10 次 / 分，10~100 V\\) 的電刺激，刺激強度以閾刺激強度 \\(T\\) 的倍數表示，分析記錄到的 iVLF-EPSP 的各個參數與刺激強度的相關性，在一個 MN 記錄到的 iVLF-EPSP 呈刺激強度依賴性結果例示如圖1A。直線相關分析結果顯示，在 1.0T~1.3T 范圍內，EPSP 的幅度、曲線下面積和最大上升斜率均與刺激強度呈正相關 \\(P < 0.05 或P < 0.01\\)，且 1.3T 時 EPSP 幅度增大到 1.0T 時的300% 左右 \\( 圖 1B~D\\)。2.2 iVLF-EPSP表觀受體動力學參數的刺激強度依賴性。對不同強度電刺激誘發的 iVLF-EPSPs 進行表觀受體動力學分析，顯示刺激強度在 1.0T~1.3T 時，表觀受體動力學參數 K2和 KT與刺激強度均呈負相關 \\(P < 0.05，圖 2\\)。2.3 iVLF-EPSP的LTP現象通過置于 iVLF 的同芯雙極刺激電極，給予iVLF 測試刺激 \\( 單脈沖，波寬 0.1~0.3 ms，10 次 / 分，10~100 V\\) 記錄到穩定的 EPSP 15 min 后再給予強直刺激 \\(100 Hz，50 脈沖 / 串，波寬 0.4~1.0 ms，共6 串， 串 間 隔 10 s，10~100 V\\)， 在 測 試 的 11 個MNs 中，有 5 個 MNs 的 EPSP 幅度在強直刺激后增大到基礎值的 120% 以上，且維持至少 30 min，可以被判定誘發了 LTP \\(iVLF-LTP\\)\\( 圖 3A\\)，同時EPSP 的曲線下面積 \\( 圖 3B\\)、最大上升斜率 \\( 圖3C\\) 均增大到基礎值的 120% 以上。
2.4 iVLF-LTP過程中iVLF-EPSPs受體動力學的變化。選擇誘發出 iVLF-LTP 的 5 個 MNs 進行表觀受體動力學分析，結果表明在 iVLF-LTP 過程中，iVLF-EPSPs 的 K1未呈現規律性變化，而有 3 個 MNs 中K2和 KT明顯減小，在強直刺激后 10 min 內減小到基礎值的 80% 以下，后逐漸有所恢復 \\( 圖 4B、C\\)，但在剩余 2 個 MNs 未發生明顯變化。
3 討論
本研究觀察到的現象是 iVLF-EPSP 的表觀受體動力學參數在 1.0T~1.3T 范圍內，具有刺激強度依賴性，如表觀解離速率常數 K2和表觀平衡解離常數 KT均與刺激強度呈高度負相關。同時，iVLF-EPSP 的幅度在 1.3T 刺激強度時可增大到 1.0T 刺激強度時的 300% 左右，這在 LTP 分析中可能是比較強的突觸效能增強作用。這些觀察結果提示了 iVLF-EPSP 表觀受體動力學參數分析，可能在 iVLF-LTP的受體動力學分析中有一定的參考價值。
就本研究的 iVLF-EPSP 而言，介導突觸反應的離子通道型谷氨酸受體可能有 NMDA 受體、AMPA受體和 KA 受體。已有研究表明，KA 受體在 iVLF-EPSP 中的作用可能很小，因為 AMPA 受體拮抗劑和 NMDA 受體拮抗劑能夠完全阻斷刺激誘發的反應，而且本實驗室前期研究結果提示，生理情況下 VLF-EPSP 可能主要由 non-NMDA 受體介導。
EPSP 具有刺激強度依賴性，在本實驗中，EPSP 的幅度等參數都與刺激強度呈高度正相關。AMPA 受體的特點是快速脫敏和低親和力；而 NMDA受體介導的電流不僅上升慢，衰減也特別慢，可能與 NMDA 受體的功能亞基 NR2 與谷氨酸的親和力較高有關。本結果顯示，K2值隨著刺激強度的增大而減小，提示遞質與受體分離減慢，且 KT值與刺激強度亦呈負相關，遞質與受體作用的親和力隨刺激強度增大而增強。在 iVLF-EPSP，這種親和力的增強可能與 NMDA 受體的激活有關 ，但其它可能的受體機制是否參與仍需進一步研究。
給予 iVLF 強直刺激，5 個 MNs 的 iVLF-EPSP幅度表現為顯著增大到或超過基礎值的 120%，并且至少維持 30 min，根據在其它腦區的 LTP 判斷標準，可以判定發生 iVLF-LTP。在脊髓背角，NMDA 受體激活是觸發中樞敏化的必要條件，高頻刺激使突觸后膜去極化，封閉 NMDA 受體的 Mg2+被移除，NMDA 受體激活，Ca2+內流激活鈣敏感的胞內信號級聯導致 NMDA 受體和 AMPA 受體的磷酸化，產生 LTP。使用 APV 阻斷 NMDA 受體可以阻斷 LTP 的誘導，而在 LTP 的維持中，突觸后 AMPA 受體量明顯上調。本研究選擇誘發出iVLF-LTP 的 5 個 MNs 進行 EPSP 的表觀受體動力學分析，其中 3 個 MNs 的 iVLF-EPSP 的表觀平衡解離常數 KT值在強直刺激后 10 min 內明顯減小，后逐漸部分恢復，提示在部分 iVLF-LTP 有遞質與突觸后受體的親和力增大現象，這首先要考慮強直刺激后有大量高親和力的 NMDA 受體被激活所致的可能性，其后 LTP 維持中 AMPA 受體數量的上調則可能是導致親和力有所恢復的原因之一。另外，不同類型 NR2 亞基的 NMDA 受體，其失活時間不同，大小順序為 NR2A < 2C = 2B << 2D。已有研究顯示 NMDA-2B 受體拮抗劑 Ro 25-6981 能夠明顯減弱強直刺激后脊髓 C 纖維 LTP 的幅度，表明含NR2B 亞基的 NMDA 受體的激活與脊髓 LTP 的維持有關。更有報道，不僅在 LTP 的產生機制中，突觸外 NR2B 的側向位移至突觸部位貢獻其中，而且突觸外的含 NR2D 的 NMDA 受體在 LTPNMDA中被補充到突觸部位。盡管以上研究結果均提示iVLF-LTP 過程中突觸后受體親和力的提高可能與NMDA 受體的激活、NR2B、2D 亞基的參與有關，但局部神經元網絡、LTP 產生機制的復雜性，以及發育過程中 NMDA 亞基表達有一個從 NR2B 到NR2A 的轉換過程等，均強烈提示 iVLF-LTP 過程中突觸后受體親和力是否升高可能涉及更多因素，如其它神經遞質的參與、受體的表達與修飾等，這些均值得進一步研究。
綜上所述，本研究的受體動力學分析顯示，在iVLF-LTP 過程中 iVLF-EPSP 表觀受體動力學參數K2和 KT出現明顯減小，可能表明突觸后受體親和力的升高，不僅提示了所涉及的受體機制以及其它相關機制需進一步的研究，也為相關突觸傳遞的可塑性研究提供了一種可以參考的分析方法。
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