原發性痛經在婦科病癥中是常見病、多發病,常常影響人們工作、學習和健康,因此,引起人們的廣泛關注,其發病機理有待于進一步研究。經前止痛方是以《刪補名醫方論》所載佛手散為基礎,臨床加減使用治療原發性痛經的方劑。處方中把當歸和川芎按照 3 ∶ 1 比例配伍,重用當歸為君藥活血、養血、補血、和血對血瘀血虛之疼痛均有“通”和“榮”之效,并配以益母草、赤芍和桂枝等。以川芎、益母草為臣,行血活血,行氣之郁,活血之瘀,共同起到養血和血行氣化瘀止疼之效。赤芍涼血消腫、化瘀止痛為佐; 以桂枝溫通為使,緩拘急而止疼。全方共同起到養血行血和血,調經行瘀止痛的作用。JQF 臨床用藥特點是,只在月經前 3天使用本次月經無疼痛,連續服用 3 個月經周期,從第四個月經周期起停止服藥,連續追蹤 3 個月經周期,復發率低于4%。JQF - A - N - 30、JQF - A - E 是 JQF 的兩個活性部位,本實驗在前期研究基礎上,為深入探討該藥的作用機制,并進一步了解前列腺素及雌激素、縮宮素受體在PD 中的發病機理,本實驗以阿司匹林為對照藥,觀察兩個有效部位對痛經大鼠子宮組織前列腺素含量、雌激素受體\\(ER\\) 、縮宮素受體\\(OTR\\) 相關的影響。
1、 實驗材料
1. 1 實驗動物
SD 雌性健康大鼠,未孕,體重選擇在 180 ~ 220 g 之間,在天津中醫藥大學二級動物實驗室\\(實驗動物中心\\) 條件下飼養。提供單位: \\(合格證號: SCXK\\(京\\) 2010 - 0002\\) 中國醫學科學院放射醫學研究所動物室。
1. 2 藥物與試劑
JQF 基礎方\\(當歸、益母草、川芎、赤芍、桂枝\\) ,購自天津?？滇t院,并經生藥學鑒定。
JQF - A - N - 30 的制備: 上述配方取各味生藥,粉碎后用水煎煮 3 次,每次 2 h。濾液合并后濃縮并進行大孔樹脂柱層析分離,依次以水、30% 乙醇洗脫,30% 乙醇洗脫部位經濃縮,冷凍干燥為 JQF - A - N -30,出膏率為 1. 98%。
JQF - A - E 的制備: 按上述配方取各味生藥,粉碎后用 95%乙醇加熱回流提取兩次,每次 2 h,過濾后合并 95%乙醇提取液,將乙醇提取液濃縮至無醇味,得乙醇提物 JQF- A。將此醇提物經乙酸乙酷萃取,萃取液濃縮得 JQF - A- E,出膏率為 2. 77% 。
上海一化藥業有限公司生產的縮宮素注射液\\(10 IU,1mL\\) ,\\(批號: 040912\\) ; 天津金耀氨基酸有限公司生產的己烯雌酚\\(diethylstilbestrol\\) 注射液\\(0. 5 mg,1 mL\\) ,\\(批號:0806021\\) ; 石藥集團歐意藥業有限公司生產的阿司匹林腸溶片25 mg/片\\(批號: 018100725\\) ; 大鼠前列腺素 F2α\\(PGF2α\\)ELISA 試劑盒\\(批號 20110701A\\) ,大鼠前列腺素 E2\\(PGE2\\)ELISA 試劑盒\\(批號 20110701A\\) ,均購自上海寶曼生物科技有限公司; 2* taq plus PCR masterMIX\\(批號 K9104\\) ,QuantcDNA 第一鏈合成試劑盒\\(批號: K9411\\) : 天根生化科技有限公司; PCR 反應引物、1000 bp DNA Ladder Marker: TaKaRa 購自上海生工生物工程技術服務有限公司。
1. 3 儀器設備
勻漿機: IKA T -18 basic; MVS -1,由北京北德科學器材有限公司生產的渦旋混合器; PCR 擴增儀\\(HYBAID\\) ;離心機\\(美國 BECKMAN\\) ; 電泳儀\\(北京六一儀器廠\\) ;SYNGENE,GENE GENIUS 凝膠成像分析儀。BECKMAN 核酸蛋白分析儀,美國。
2、 實驗方法
2. 1 制作模型和分組灌胃
制作雌性大鼠痛經模型: 選取體重 180 ~220 g 健康雌性大鼠\\(未孕\\) ,連續 10 d 己以己烯雌酚皮下注射,第 1、10兩天皮下注射給藥量為每只每天 0. 5 mg,其余 8 日均為每只每天 0. 2 mg,末次己烯雌酚注射后間隔 40 h,腹腔注射縮宮素 2U/只\\(生理鹽水稀釋\\) 。
將大鼠分為 JQF - A - N -30 組、JQF - A - E 組、模型對照組、阿司匹林對照組、正常對照組。JQF - A - N - 30組、JQF - A - E 組每天每只大鼠灌胃給予濃度為 1. 5 g/mL的浸膏干粉 1 mL,阿司匹林對照組每天每只大鼠灌胃給予濃度為 5 mg/mL 的阿司匹林片 1 mL,正常對照組、模型組每天灌胃等體積生理鹽水,即連續 10 d,每天灌胃 1 次。
2. 2 子宮組織 PGF2α、PGE2含量測定末次給予縮宮素 1 h 后,將大鼠脫臼處死,解剖,分離出子宮,精確稱取各組動物同側同位段新鮮子宮 150 mg,生理鹽水沖洗兩次,加勻漿液\\(無水乙醇∶ 生理鹽水 =1 ∶ 9\\)2 mL,以 3000 r / min,立即勻漿,離心 10 min\\(4℃\\) ,提取上清液體。用 ELISA 法測定 PGF2α、PGE2。
2. 3 RT - PCR 法考察 JQF 活性部位干預對子宮組織OTR、ER - α 表達的影響2. 3. 1 引物序列與擴增片段長度見表 1。
2. 3. 2 提取 RNA 和逆轉錄聚合酶鏈反應\\(RT - PCR\\)子宮組織 RNA 的提取: 稱取子宮組織80 ~90 mg,按試劑盒說明書提取總 RNA。使用核酸蛋白分析儀對提取的 RNA含量及純度進行計算。RT 反應: 建立 20 μL 反應體系,使用 PCR 儀反應 1 h\\(37℃\\) 。RT - PCR 反應: 建立 25 μL 反應體系,在 RT - PCR 儀上檢測各樣本基因表達\\(條件見表1\\) ,以 β - actin 作為內參照,取 PCR 產物,瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下檢查有無特異性條帶。在凝膠圖像處理分析系統中掃描電泳帶,以 RNA 含量 = \\(目的基因—β - ac-tin\\) / β - actin 為公式,統計電泳帶的積分值。
3、 統計方法
使 SPSS 11. 5 統計軟件進行數據處理,實驗數據以 x珋 ±s 表示,采用單因素方差分析 LSD 方法統計,組間比較用Dunnett't 檢驗。
4、 結 果
4. 1 JQF 活性部位對痛經模型大鼠子宮中 PGF2α、PGE2含量變化的影響6結果表明,模型組大鼠子宮組織 PGF2α含量明顯高于正常對照組,與模型組比較,阿司匹林陽性對照組、JQF - A- N - 30 的 PGF2α含量具有顯著性差異 \\(P <0. 01\\) ,JQF -A - E 的 PGF2α含量亦有差異 \\(P <0. 05\\) ; 模型組大鼠子宮組織 PGE2含量明顯高于正常對照組,與模型組比較,阿司匹林陽性對照組、JQF - A - N - 30、JQF - A - E 的 PGE2含量有差異 \\(P <0. 05\\) ,見表 2。
4. 2 JQF活性部位干預對子宮組織OTR,ER一。表達的影響見圖1,表3。實驗結果顯示,模型組大鼠子宮組織OTR,ER一?；虮磉_較正常組明顯上調,與模型組比較,阿司匹林陽性對照組、JQF - A - N - 30、JQF - A - E 的OTR、ER - α 基因表達均有所降低,結果見表 3。
5、 討 論
現代醫學研究發現,原發性痛經可能與 ER、PG、OTR等因素有關,本實驗采用酶免法對照觀察了痛經大鼠子宮前列腺素含量\\(PGF2α、PGE2\\) 的變化,RT - PCR 法檢測了OTR、ER - α 的變化,結果表明,JQF 活性部位可顯著降低ER、PG、OTR 水平。
病理狀態下 E2是促進子宮對 OT 的敏感性的重要物質,而且 E2可增加大鼠子宮和人蛻膜培養物中縮宮素基因的表達。OT 直接作用在大鼠子宮平滑肌細胞引起宮縮,子宮內膜細胞受到影響后使 PGs 水平升高,形成和加重疼痛。JQF 活性部位可使 PGF2α所致的大鼠子宮肌痙攣直接得到抑制,有效緩解疼痛。實驗顯示: 降低大鼠子宮組織PGF2α水平是 JQF 活性部位治療原發性痛經的作用機制。
前期二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗,熱刺激所致小鼠疼痛實驗,痛經模型小鼠扭體反應實驗和大鼠離體子宮實驗等實驗已經證明 JQF - A - N -30、JQF - A - E 可以顯著抑制 PGF2α和縮宮素引起的子宮平滑肌條劇烈收縮,尤其對收縮頻率加快的抑制作用較強,同時具有抗炎作用。本次實驗通過 ELISA 法和 RT - PCR 法使其得到進一步驗證。
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