羅仙子原名家蠅蛆,又稱五谷蟲,為傳統中藥材之一.羅仙子具有多種治療效果,如調節免疫功能、促進組織愈合、降血脂和抗菌等功效[1].本課題組前期研究發現羅仙子粉及其提取物均能有效治療動脈粥樣硬化\\(atherosclerosis,AS\\)[2].
目前研究認為炎癥過程在AS的發病中扮演了重要作用,單核細胞和血管內皮細胞的黏附、遷移誘導了AS的 形 成.本 研 究 觀 察 相 對 分 子 質 量30 000以下羅仙子提取物對單核細胞與血管內皮細胞黏附的影響,并簡要探討其機制.
1材料與方法
1.1細胞和培養 EA.hy926、THP-1細胞購買于中山大學實驗動物中心.EA.hy926培養采用10%胎牛血清DMEM低糖培養基,THP-1培養采用10%胎牛血清RPMI1640培養基,細胞均置于37℃、5%CO2濃度的培養箱中靜置孵育培養.EA.hy926待細胞融合度達到80%進行傳代,THP-1每隔2~3d,培養基變黃后進行分瓶.
1.2試劑和儀器 羅仙子提取物自制;單核細胞趨化 蛋 白-1\\(MCP-1\\)、血 管 細 胞 黏 附 分 子-1\\(VCAM-1\\)ELISA試 劑 盒 \\(CUSABIO,中 國\\);MTT\\(Sigma,美國\\);PBS\\(博士德,中國\\);重組人TNF-α\\(PeproTech,美國\\);DMSO\\(Amresco,美國\\);DMEM低糖培養基\\(Hyclone,美國\\);RP-MI1640\\(Hyclone,美國\\);胎牛血清\\(Hyclone,美國\\);酶標儀\\(Bio-Rad,美國\\);倒置顯微鏡\\(Olym-bus,日本\\);CO2培養箱\\(HERAS,德國\\);超凈臺\\(江蘇凈化,中國\\).
1.3羅仙子提取物的制備 人工飼養家蠅幼蟲,于2日齡采用冷熱交替刺激后,次日對幼蟲進行清洗、消毒處理后,按1∶3\\(m∶v\\)的比例加入單蒸水進行勻漿,勻漿液用200目的紗網過濾,得濾液;超 聲 破 碎:工 作10s,暫 停5s,交 替 工 作15min;超高速冷凍離心機4℃,12 000r/min,工作30min后收集上清液;濾液在-80℃冰凍2h后,進行冷凍干燥,得到羅仙子粗蛋白質粉;蛋白粗粉重溶后分別通過100 000分子超濾膜和30 000分子濾膜獲得相對分子質量30 000以下羅仙子提取物.
1.4內皮細胞活力檢測 取對數期生長期的EA.hy926,接種于96孔 板,每 孔200μL\\(1×104/mL\\),細胞貼壁生長后48h更換培養液,按下列濃度加入系列濃度的相對分子質量30 000以下羅仙子提取物的培養液\\(0、4×102、4×101、4×100、4× 10-1、4× 10-2、4× 10-3、4×10-4μg/mL\\),每組設6個復孔,37℃及飽和濕度下培養24h.每孔內加入20μL\\(5mg/mLMTT\\)溶液,繼續培養4h.吸取孔內液體,加入150μL DMSO,在酶標儀OD490nm處測量各孔的吸光度值[3].
1.5羅仙子提取物對單核細胞與TNF-α活化的血管內皮細胞黏附的影響 EA.hy926接種于96孔板,待細胞培養至單層后,更換含有10ng/mLTNF-α和不同濃度藥物\\(200、100、50、25、12.5、6.25和3.12μg/mL\\)的培養基,其中模型組只添加含有10ng/mL TNF-α的培養基,空白對照組使用空白培養基,處理24h后,在每孔加入3×105個THP-1細 胞,37℃及飽和濕度下培養1h,用PBS洗去未黏附細胞,每孔加入10μL虎紅\\(0.25%\\),室溫下作用10min,用PBS洗去游離虎紅,每孔加入200μL乙醇-PBS溶液\\(1∶1\\),作用1h后,采 用 酶 標 儀 測 定490nm的OD值[4].
1.6羅仙子提取物對血管內皮細胞黏附分子表達的影響.
EA.hy926接種于96孔板,待細胞培養至單層后,更換含有10ng/mL TNF-α和不同濃 度 藥 物 \\(200、100、50、25、12.5、6.25和3.12μg/mL\\)的培養基,其中模型組只添加含有10ng/mL TNF-α的培養基,空白對照組使用空白培養基,每組3個復孔,處理24h后,收集培養上清液,離心去除細胞后采用ELISA試劑盒檢測VCAM-1和MCP-1.
1.7統計學處理.
用SPSS 13.0軟件進行統計分析,計量資料比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統計學意義.
2結果.
2.1羅仙子提取物對內皮細胞活力的影響 4×102μg/mL羅仙子提取物具有促進EA.hy926增殖的作用\\(P<0.05\\),而低于該濃度,羅仙子提取物對EA.hy926未見明顯的增殖或抑制作用\\(P>0.05\\).見表1.
2.2羅仙子提取物對單核細胞與TNF-α活化的血管內皮細胞黏附的影響 通過TNF-α的誘導,黏附于EA.hy926的單核細胞THP-1顯著增加\\(P<0.01\\);3.12μg/mL羅仙子提取物可降低兩細胞之間的黏附作用\\(P<0.05\\),而羅仙子提取物≥3.12μg/mL時,單核細胞與TNF-α活化的血管內皮細胞黏附均發生顯著降低\\(P<0.01\\).
見表2.
2.3羅仙子提取物對TNF-α活化的血管內皮細胞分泌 MCP-1和VCAM-1的影響與模型組比較,各給藥濃度均能顯著降低MCP-1的表達\\(P<0.01\\);與模型組比較,藥物濃度≥50μg/mL時,VCAM-1發 生 顯 著 的 降 低 \\(P<0.01\\),而50μg/mL≥藥物濃度>3.12μg/mL,VCAM-1發生一定程度的降低\\(P<0.05\\).見表3.
3討論
羅仙子作為傳統中藥,其具有多種藥理藥效.在本課題組的研究中發現羅仙子具有顯著的抗AS作用,能有效地降低膽固醇\\(TC\\)、甘油三酯\\(TG\\)和低密度脂蛋白\\(LDL\\),升高高密度脂蛋白\\(HDL\\),超氧化物歧化酶\\(SOD\\)活力升高,丙二醛\\(MDA\\)水平下降,具有良好的抗炎和抗氧化作用[5].進一步的研究中,對羅仙子進行了分離純化,通過體內外研究發現羅仙子30 000以下成分為其最有效成分,其可通過抑制NF-κB信號通路從而減少下游相關炎癥因子的表達、調控巨噬細胞與內皮細胞之間的相互關系及保護內皮細胞等作用發揮抗AS作用[6].現代研究認為AS病變的發生發展過程就是一系列由炎癥細胞和炎癥因子參與的炎癥反應過程,多種炎癥因子被確認為AS的 標 志 物,如TNF-α、IL-6和MCP-1等[7].TNF-α可使內皮細胞 活 化 產 生 一 系 列 黏 附 分 子 如VCAM-1、ICAM-1及MCP-1等,從而使單核細胞與血管內皮細胞發生黏附,并在多種因子的作用下分化為成熟的巨噬細胞或樹突狀細胞,而成熟的巨噬細胞由于吞噬氧化低密度脂蛋白轉化為泡沫細胞,從而導致了AS斑塊的形成[8].由此可見,有效抑制單核細胞與內皮細胞之間的早期黏附可有效抑制AS的產生.
本研究中發現TNF-α處理EA.hy926后與THP-1細胞的黏附作用顯著增強,而不同濃度羅仙子提取物均能降低TNF-α誘導的EA.hy926后與THP-1細胞的黏附作用,說明羅仙子提取物可能通過降低單核細胞與血管內皮細胞之間的黏附作用從早期抑制AS斑塊的形成.
TNF-α是人體重要的炎性細胞因子.活化單核巨噬細胞分泌TNF-α,后者與內皮細胞胞膜上的TNF-α受體\\(TNFR\\)相結合[9],發揮生物學效應,從而誘導內皮細胞的衰老和凋亡,此外血管內皮細胞在TNF-α作用下可分泌大量促炎性細胞因子[10].本研究中發現正常血管內皮細胞可低表達VCAM-1和MCP-1,而在TNF-α誘導下均發生顯著的提高,不同濃度羅仙子提取物可濃度依賴性降低VCAM-1和MCP-1水平,這也可能是羅仙子提取物降低單核細胞與血管內皮細胞的之間的黏附作用的可能機制,但羅仙子提取物是否直接作用于TNFR受體或者影響TNFR下游NF-κB通路其確切機制有待進一步研究.
參 考 文 獻
[1] 黃健,莫非.家蠅幼蟲抗菌肽對幽門螺桿菌抗菌作用分析[J].中國人獸共患病學報,2013,29\\(10\\):981-985.
[2]Chu FJ,Jin XB,Ma Y,et al.Inflammatory Regula-tion Effect and Action Mechanism of Anti-Inflam-matory Effective Parts of Housefly\\(Musca domes-tica\\)Larvae on Atherosclerosis[J].Evid BasedComplement Alternat Med,2013,2013:340267.
[3] 陳麗,張建,汪思應,等.胡桃醌對血管形成的影響及其機制初探[J].中國臨床藥理學與治療學,2010,15\\(4\\):403-410.
[4] 何秀娟,呂喆,龍軍,等.瘍愈涂劑對人白細胞與血管內皮細胞黏附影響的分子機制[J].首都醫科大學學報,2010,31\\(6\\):752-755.
[5] 肖明珠.家蠅蛆粉對ApoE-/-小鼠抗動脈粥樣硬化作用及其機制的探討[D].廣州:廣東藥學院,2011.
[6] 褚夫江.家蠅蛆粉抗高血脂與動脈粥樣硬化的研究[D].廣州:廣東藥學院,2009.
[7] 方海洋,吳延慶.4項動脈粥樣硬化的相關因子研究進展[J]重慶醫學,2013,\\(32\\):3958-3961.
[8] 陳麗紅,管又飛.巨噬細胞移動抑制因子及其在動脈粥樣硬化中的作用【J】.生理科學進展,2006,37\\(1\\):45-47.
[9] 方麗娟,劉乃豐.二甲雙胍的心血管保護作用[J].中國臨床藥理學與治療學,2011,16\\(2\\):232-236.
[10]崔廣智,金樹梅,趙桂峰,等.丹參酮ⅡA對TNF-α誘導的ECV304細胞NF-κB、IκB-α表達及黏附分子ICAM-1、VCAM-1mRNA表達的影響[J].中國藥理學通報,2007,23\\(12\\):1671-1675
