Ghrelin 是生長激素促分泌素受體\\( growth hor-mone secretagogue receptor，GHS-R\\) 的內源性配體，主要由胃黏膜組織中的泌酸細胞分泌。Ghrelin 的生物學作用十分廣泛，可促進生長激素分泌; 調節攝食和能量代謝; 刺激胃動力和胃酸分泌; 調節心血管功能等。新近研究發現，ghrelin 與消化道運動關系密切，外周和中樞給予 ghrelin 可加速胃排空，改善術后腸梗阻，促進胃和十二指腸消化間期復合肌電活動。Gong 等用蛋白印跡方法和聚合酶鏈反應\\( polymerase chain reaction，PCR\\) 技術發現 GHS-R在大鼠的下丘腦有表達; Gnanapavan 等用 PCR 技術證實，ghrelin 和 GHS-R 在人的胃、小腸、結腸、胰腺、膽囊、肺臟、垂體、卵巢、血管等處均有表達;Dass和 Xu 等利用熒光免疫組織化學方法在人、大鼠和豚鼠的胃和結腸也發現了 ghrelin 及其受體。然而，關于 ghrelin 和 GHS-R 在中樞的組織細胞學分布及表達量的比較尚未見報道。此外，由于新鮮腦組織比較難以判定各核團的精確界線，PCR及蛋白印跡技術只能分離出大鼠的部分腦區\\( 如海馬和下丘腦\\) ，不能分離出其中包括的微小核團和亞核團，并進行表達量比較。因此，作者采用免疫組織化學和圖像分析方法觀察大鼠中樞 ghrelin 和GHS-R 的分布，重點分析比較二者在與消化功能相關腦區的表達，為闡明中樞給予 ghrelin 的促胃腸動力作用提供理論依據。

1 材料與方法

1． 1 實驗動物 健康純種 Sprague-Dawley 大鼠 8只，雌雄不拘，體質量 220 ～240 g，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供。

1． 2 主要試劑與儀器 兔抗人 GHS-R 抗體購自美國 Santa Cruz 公司，兔抗鼠 ghrelin 抗體購自美國鳳凰生物制品有限公司，鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物\\( strept-avidin-biotin complex，SABC\\) 羊抗兔免疫組織化學試劑盒購自武漢博士德公司，二氨基聯苯胺\\( diaminobenzidine，DAB\\) 顯色試劑盒購自北京中山生物技術有限公司，Q550CW 型圖像采集與分析系統購自德國 Leica 公司。

1． 3 取材與標本制備 實驗大鼠用含 100 g·L－ 1的水合氯醛400 mg·kg－ 1腹腔注射麻醉，經左心室穿刺至主動脈，用生理鹽水快速沖血管，含 40 g·L－ 1的多聚甲醛緩沖液經升主動脈灌注。取出大腦和小腦，切成厚4 mm 小塊，40 g·L－ 1的多聚甲醛緩沖液固定8 h，用含質量分數 20% ～ 30% 的蔗糖溶液梯度脫水，液氮速凍后，組織包埋劑包埋，恒冷冰凍切片機切片。腦片行連續切片，厚15 μm。

1． 4 免疫組織化學染色 用 SABC 法進行 ghrelin和 GHS-R 的免疫組織化學染色。具體步驟如下: 冷凍切片用磷酸鹽緩沖液\\( phosphate buffered saline，PBS\\) 浸泡 5 min，加入檸檬酸緩沖液\\( pH 6． 0\\) ，微波修復，晾至室溫，PBS 沖洗3 次，每次 5 min; 體積分數3% 的過氧化氫溶液\\( hydrogen peroxide，H2O2\\) 浸泡30 min，PBS 沖洗 3 次，每次 5 min; 體積分數 0． 5% 的聚乙二醇辛基苯基醚\\( triton X-100\\) 浸泡 20 min，PBS沖洗3 次，每次5 min。體積分數 10%正常山羊血清封閉\\( 37 ℃，30 min\\) ，甩去多余液體，切片分別滴加兔抗鼠 ghrelin 抗體\\( 1: 2 500\\) 和兔抗人 GHS-R 抗體\\( 1:100\\) ，4 ℃過夜，PBS 沖洗3 次，每次5 min，滴加羊抗兔抗體\\( 37 ℃，40 min\\) ，PBS 沖 洗 3 次，每 次10 min，滴加生物素化的辣根過氧化物酶復合物\\( avidin-biotinylated horseradish peroxidase complex，ABC\\) \\( 37 ℃ ，20 min\\) 。PBS 沖洗 3 次，每次 10 min，DAB 顯色，中性樹膠封片，用圖像分析系統觀察 ghre-lin 和 GHS-R 陽性表達。用 PBS 代替一抗做陰性對照，其余步驟不變。

本實驗選取與消化功能相關的核團進行重點觀察，并分析了 ghrelin 和 GHS-R 陽性反應細胞在各核團不同分區的表達。中樞陽性細胞計數: 每只大鼠計數 5 張切片，每張切片在陽性細胞最密集處隨機選取 5 個視野計數，取平均值作為該切片的陽性細胞數。對每只大鼠同一腦區的 ghrelin 和 GHS-R陽性細胞記數時必須選擇在相同平面。

1． 5 統計學處理 應用 SPSS 13． 0 統計軟件進行數據分析，免疫反應陽性細胞數以均數 ± 標準差\\( x珋 ± s\\) 表示，多組間比較采用方差分析，P ＜0. 05 為差異有統計學意義。

2 結果

2． 1 Ghrelin 與 GHS-R 免疫陽性細胞的染色特征在大鼠中樞神經系統，ghrelin 與 GHS-R 免疫陽性細胞廣泛分布于多個腦區，二者的陽性表達類似，陽性細胞為細胞膜和\\( 或\\) 細胞質有棕黃色顆粒沉著，細胞核無棕黃色顆粒沉著。二者的免疫強陽性反應在大腦皮質、下丘腦、丘腦室周核、海馬\\( hippocamp，HIP\\) 、杏仁核、小腦及腦干等部位均可見 \\( 圖 1、圖 2\\) ?！緢D1-2略】

2． 2 Ghrelin 和 GHS-R 免疫陽性細胞在與消化道功能相關腦區的表達 在下丘腦區室旁核\\( periven-tricular nucleus，PVN \\) 、弓 狀 核 \\( arcuate nucleus，ARC\\) 、視前核\\( preoptic nucleus，PON\\) 、視上核\\( su-praoptic nucleus，SON\\) 、下丘腦外側區\\( lateral hypo-thalamic area，LH\\) 、下丘腦腹內側核 \\( ventromedialhypothalamic nucleus，VMH\\) 、下丘腦背內側核\\( dor-somedial hypothalamic nucleus，DMH\\) 、下丘腦背側核\\( dorsal hypothalamic nucleus，DO\\) 等處均可見 ghre-lin 及 GHS-R 陽性反應細胞。陽性細胞的細胞膜為棕黃色顆粒沉著，細胞核無棕黃色顆粒沉著。其中，ghrelin 在 PVN 和 LH 陽性反應最強，免疫反應陽性細胞數分別為116． 31 ±7． 76 和107． 02 ±8． 80，明顯高于 ARC\\( 75． 12 ± 5． 59\\) 、DMH\\( 56． 84 ± 7． 07\\) 和VMH\\( 62． 54 ± 6． 93 \\) ，差異有統計學意義 \\( P ＜0. 05\\) \\( 圖 1、圖 3\\) ; GHS-R 在 PVN 和 ARC 陽性反應強，免疫反應陽性細胞數分別為 111． 06 ± 11． 80 和97． 06 ± 10． 37，明顯高于 LH\\( 74． 70 ± 6． 04\\) 、DMH\\( 58． 65 ±7． 28\\) 和 VMH\\( 48． 24 ± 6． 58\\) ，差異有統計學意義\\( P ＜ 0． 05\\) ; 陽性細胞染色深，數目多，細胞體呈圓形或橢圓形，多數細胞有粗短突起。其余核團陽性細胞數目較少，分布稀疏，染色呈淡黃色\\( 圖 2、圖 3\\) ?！緢D3】


Ghrelin 和 GHS-R 在 HIP 的 CA1、CA2、CA3、CA4 區的顆粒層均有分布，細胞多數呈橢圓形，細胞膜呈深棕色，細胞體較小，分布密集。其中，ghrelin在 CA3 區陽性反應最強，免疫反應陽性細胞數為123． 20 ± 11． 17，明顯高于 CA1\\( 67． 46 ± 6． 93\\) 、CA2\\( 37． 91 ±5． 21\\) 、CA4\\( 59． 96 ±6． 73\\) 區，差異有統計學意義\\( P ＜ 0． 05\\) \\( 圖 1、圖 4\\) ; GHS-R 在 CA3 和CA4 區均有強陽性反應，免疫反應陽性細胞數分別為 103． 79 ± 9． 23 和 86． 48 ± 7． 25，明顯高于 CA1\\( 51． 16 ±6． 56\\) 、CA2\\( 43． 39 ±5． 11\\) 區，差異有統計學意義\\( P ＜0． 05\\) 。錐體細胞層可見二者的強陽性反應\\( 圖 2、圖 4\\) ，細胞膜著深棕色，細胞體較大，呈圓形、橢圓形或錐形，突起粗短，著色明顯，細胞質淡染。二者在分子層均未見著色?！緢D4】


在杏仁核區，ghrelin 和 GHS-R 陽性細胞細胞膜和\\( 或\\) 細胞質為棕色顆粒沉著，細胞核不著色。二者均在杏仁內側核\\( medial amygdaloid nucleus，Me\\)呈強 陽 性 反 應，免 疫 反 應 陽 性 細 胞 數 分 別 為140． 22 ± 9． 07 和 115． 66 ± 7． 35，明顯高于杏仁基底內側核 \\( basomedial nucleus of the amygdale，BM\\)\\( 67． 84 ±7． 36\\) 、杏仁基底外側核前部\\( anterior divi-sion of the basolateral nucleus of the amygdale，BLA\\)\\( 33． 46 ±4． 24\\) 、杏仁基底外側核后部\\( posterior di-vision of the basolateral nucleus of the amygdale，BLP\\)\\( 43． 06 ±6． 24\\) 、杏仁中央核\\( central amygdaloid nu-cleus，CeA\\) \\( 22． 58 ± 3． 60\\) 、杏仁外側核\\( lateral a-mygdaloid nucleus，LA\\) \\( 31． 95 ± 5． 77\\) ，差異有統計學意義\\( P ＜0． 05\\) \\( 圖 1、圖 2、圖 5\\) ，細胞體多數呈橢圓形，細胞膜為深棕色，許多細胞有短粗突起。

Ghrelin 在 BLA 與 BLP 也有較多陽性細胞，細胞體較大，有短粗突起，形態以圓形居多，細胞膜染色呈淡棕色。GHS-R 在 BM 有較多陽性細胞，細胞體較小，呈圓形或橢圓形，染色呈棕黃色。在 CeA 和LA，二者的陽性細胞數目較少，細胞體較小，染色呈淡黃色。

2． 3 Ghrelin 和 GHS-R 免疫陽性細胞在中樞其他部位的表達 在大腦皮層區，各層均有 ghrelin 與GHS-R 陽性反應細胞。二者在分子層、外顆粒層、多形細胞層陽性反應均較弱，染色呈淡黃色，陽性細胞輪廓不清晰，體積較小，形態以圓形和橢圓形居多，還可見梭形細胞。在內顆粒層和外錐體細胞層，ghrelin陽性反應較強，陽性細胞呈棕黃色，輪廓清晰，形態呈圓形或橢圓形，無突起染色，細胞核不著色。GHS-R陽性表達在外錐體細胞層較多，內顆粒層較弱。在內錐體細胞層，GHS-R 和ghrelin 陽性反應均較強\\( 圖1、圖2\\) ，細胞呈棕黃色，突起染色明顯，細胞核不著色，形態多為錐形?！緢D5】


在小腦蒲肯野細胞，ghrelin 與 GHS-R 均呈強陽性反應\\( 圖 1、圖 2\\) ，細胞胞體大，呈梨形，細胞膜和細胞質著深棕色，突起無明顯著色。二者陽性反應在小腦的分子層和顆粒層較弱，細胞小而圓，細胞膜和細胞質呈棕黃色。此外，在前庭神經上核、外側核、中縫核、小細胞網狀核和面神經核等處均可見ghrelin 和 GHS-R 陽性細胞。

在延髓，ghrelin 與 GHS-R 均有強陽性反應\\( 圖 1、圖 2\\) ，細胞膜和細胞質呈深棕色，細胞體呈多形性，有明顯突起。在孤束核、迷走神經背核、延髓網狀核及最后區等處也可見 ghrelin 和 GHS-R 陽性細胞。

3 討論

新近研究發現，ghrelin 與消化道運動關系密切，可促進攝食和胃排空，增加胃酸分泌，加速小腸轉運，有效改善術后腸梗阻。近來的研究多關注于ghrelin 的組織分布，已有研究發現，ghrelin 在胃腸道和中樞神經系統均有分布，主要由胃黏膜內分泌細胞\\( 主要為 X/A 樣細胞\\) 分泌，在小腸、腎臟、下丘腦、腺垂體、胰腺、甲狀腺、心臟、卵巢及胎盤等處也有少量分泌，可通過內分泌或旁分泌形式作用于受體，在局部發揮作用。但對其受體 GHS-R 分布的研究并不充分。以往研究發現，GHS-R 主要分布于垂體、下丘腦和胃，在心臟、肺、胰腺、腸、脂肪組織及腎也有分布，參與調節內分泌與能量代謝。目前，關于二者在中樞各腦區的組織學定位及微小核團和亞核團的表達水平比較尚未見報道。作者就此進行了進一步研究，并重點分析了二者在與消化功能密切相關腦區的表達水平比較。

研究結果顯示，GHS-R 在大鼠中樞廣泛存在，陽性細胞細胞核不著色，細胞膜著黃色或棕黃色，細胞質有少量著色，主要分布于大腦皮質、下丘腦、丘腦室周核、HIP、杏仁核、小腦及腦干等部位。以往研究用蛋白印跡法和 PCR 技術證實 GHS-R 在中樞和外周均有表達，用熒光免疫組織化學方法在人、大鼠和豚鼠的胃和結腸腸神經叢也發現 ghrelin 及GHS-R。本研究結果與其結果相符，并在此基礎上進一步觀察了二者在與消化功能密切相關腦區\\( 包括核團及亞核團\\) 的表達。

下丘腦位于間腦的腹側部，構成第 3 腦室下部的底壁和側壁。除參與神經內分泌、水電解質代謝和體溫調節等功能的調整，下丘腦也是調節攝食和消化道運動的重要中樞。下丘腦從前向后分為 3 個區: 視上部位于視交叉上方，由 SON 和 PVN組成; 結節部位于漏斗的后方; 乳頭部位于乳頭體。

下丘腦與其他腦區有復雜而廣泛的纖維聯系，它不僅接受來自大腦皮質、邊緣系統、腦干的傳入纖維，還發出大量的纖維到達大腦皮質、邊緣系統、中腦、腦橋和延髓。下丘腦能通過 3 種途徑對機體進行調節: \\( 1\\) 由下丘腦核發出的下行傳導束到達腦干和脊髓的植物性神經中樞，再通過植物性神經調節內臟活動; \\( 2\\) 下丘腦的 SON 和 PVN 發出的纖維構成下丘腦-垂體束到達神經垂體，兩核分泌的加壓素\\( 抗利尿激素\\) 和催產素沿此束流到神經垂體內貯存，在神經調節下釋放入血液循環; \\( 3\\) 下丘腦可分泌多種多肽類神經激素對腺垂體的分泌起特異性刺激作用或抑制作用，稱為釋放激素或抑制釋放激素。

近來研究發現，ghrelin 的促胃腸動力作用與下丘腦密切相關，下丘腦 ARC 可參與調節其促動力作用。以往研究證實，大鼠腦內存在 ghrelin 和GHS-R，主要分布于下丘腦，但并未研究其在下丘腦主要亞核團的表達。本研究結果顯示，ghrelin和 GHS-R 免疫陽性細胞在下丘腦 PVN、ARC、LH、VMH、DMH 等處均有分布。Ghrelin 免疫陽性細胞在 LH 和 PVN 居多，GHS-R 免疫陽性細胞在 PVN 和ARC 居多。這提示在消化道運動的調節中，下丘腦發揮著重要作用，ghrelin 可能通過 PVN、ARC 及 LH發揮其生理學作用。

HIP 不僅與認知功能如學習、情感、記憶有關，也是調節內臟活動的重要中樞，它與下丘腦、杏仁核、延髓髓質有著極其復雜的相互聯系，在調節哺乳動物的進食行為、飽感及胃腸運動中發揮著重要作用。HIP 結構由 HIP 本部、齒狀回、下托、束狀回和灰被組成。它從室間孔處延至側腦室下腳頂部，全形呈弓形。依據 HIP 本部的細胞構筑可再將其劃分為 4 個亞區，分別命名為 CA1、CA2、CA3 及 CA4區，CA4 區與下托相連接。齒狀回的皮質分為分子層、顆粒層和多形層。本實驗研究結果顯示，GHS-R免疫陽性細胞在 HIP 各區均有分布。HIP 在解剖結構上屬于邊緣前腦皮質結構，邊緣系統不是一個獨立的解剖學和功能性實體，它是管理學習經驗、整合新近與既往經驗，同時啟動和調節種種行為和情感反應的復雜神經環路中重要的一部分。新近研究發現，ghrelin 可通過 HIP 發揮促進胃動力作用。作者研究發現，ghrelin 免疫陽性細胞在 HIP 的 CA3 區表達最多，GHS-R 免疫陽性細胞在 CA3、CA4 區均有廣泛表達。因此，有理由推測在 ghrelin 及其受體的生理作用中，HIP 可能發揮重要作用。

杏仁核是邊緣系統中重要的皮層下核團，位于顳葉前部、側腦室下角尖端上方，由多個解剖和功能不同的核團組成，主要分為皮質內側核群與基底外側核群，以及前杏仁區、皮質移行區 2 個大過渡區。從進化來看，皮層內側核群比較古老，基底外側核群較新。

杏仁核與腦干、丘腦、下丘腦及皮層感覺區等存在廣泛的纖維聯系，從而涉及機體許多重要生理功能的調節機制，參與情緒反應、學習記憶、生殖行為等復雜行為的整合，對攝食行為和胃腸運動的調節有重要作用。新近研究證實，杏仁核內微量注射 ghrelin可顯著改善大鼠食欲，促進攝食。本研究實驗結果表明，ghrelin 和 GHS-R 免疫陽性細胞在杏仁核各亞核團均有表達，以 Me 最多，CeA 最少; 杏仁基底外側核也有較多 ghrelin 免疫陽性細胞。因此，提示 Me和杏仁基底外側核很可能是 ghrelin 調控胃腸運動的重要中樞部位之一。

綜上所述，ghrelin 及其受體 GHS-R 在中樞各腦區廣泛存在，主要位于大腦皮質、下丘腦、HIP、杏仁核等部位。Ghrelin 可能作為神經調節遞質廣泛作用于中樞各腦區，發揮各種生理調節作用。在與消化功能密切相關的腦區，二者表達量較多，在 HIP、杏仁核及下丘腦均有強陽性表達。這提示 ghrelin可能通過 GHS-R 在這些相關腦區參與調節消化道運動。