心房顫動\\(AF\\)是臨床常見病，心房重構是其重要病理生理基礎。小電導鈣激活鉀\\(SK\\)通道是鈣激活鉀通道家族成員，包括3種亞型\\(SK1～3\\)，是介導細胞內Ca2+調控與細胞膜電活動的重要離子通道。近年來發現，SK通道呈“心房選擇性”分布，且與AF發生密切相關。本課題組前期工作首次證實，慢性AF患者心房肌細胞SK1、SK2亞型下調。
但在AF早期階段，SK通道功能如何變化卻存在爭議。本研究觀察SK通道在AF早期階段心房肌細胞中的功能變化并探討其意義。
1、材料與方法
1．1動物與分組成年雄性比格犬8只，體質量13～15kg。分為快速心房起搏組5只與對照組3只。
1．2方法
1．2．1快速心房起搏犬模型的制備快速心房起搏組犬置于無菌環境、全麻狀態下\\(氯胺酮5．0mg/kg+地西泮0．2mg/kg，靜脈注射;1．5%異氟醚吸入\\)，氣管插管后機械通氣\\(潮氣量10mL/kg，頻率20次/min\\)，于胸骨右緣第5肋間開胸，暴露心臟將起搏電極縫合在右心耳部，起搏器\\(華南理工大學電子研究所制作，輸出電壓4V，脈寬0．5ms\\)頻率調至400次/min，持續起搏4h。對照組手術方法相同，但不進行起搏。
1．2．2膜片鉗全細胞記錄1．2．2．1心房肌細胞分離采用自制改良的Lan-gendorff灌流法和自制的冠脈插管裝置。分離后的左心房肌細胞保存在改良KB液中，室溫下靜置孵育6h后進行實驗。
1．2．2．2全細胞鈣激活鉀電流\\(IK，Ca\\)記錄選取紋理清晰、桿狀和大小適中的細胞在24℃條件下進行實驗。將適量細胞\\(約1．5mL\\)放于倒置顯微鏡\\(OL-PUSIX70型，日本\\)的細胞池中，貼壁8min后，開始實驗，灌流速度約1．5mL/min。在電極拉制儀\\(Nar-ishigePP830型，日本\\)分兩部拉制電極，灌電極液后電阻為2～4MΩ，并置于推進器上，通過三維操縱器\\(Narishige，日本\\)驅動電極，并輕壓在細胞表面。用負壓使電極與細胞表面形成高阻封接后，用ZAP或給負壓破膜，給予電容及串聯電阻補償，形成全細胞記錄。電流信號經Ag/AgCl電極引導，由膜片鉗AX-ON200B放大器放大通過AD/DA轉換板\\(AXONDigiDatal200，美國\\)，存儲于計算機硬盤中。實驗過程由pClAMP9．0軟件程序\\(AXON，美國\\)刺激發放和信號采集。采用pCLAMP9．0軟件對單個全細胞記錄進行數據和圖形轉換，Prism3．0軟件對數據進行曲線擬合及繪制離子通道電流密度—電壓\\(Ⅰ-Ⅴ\\)曲線。
根據文獻，本研究中將電極內液的游離Ca2+濃度設定為1000nmol/L，以最大限度地保證SK通道激活。形成全細胞封接狀態后，將細胞鉗制在－55mV，給予指令電位從－100mV～+80mV，步長20mV，波寬為500ms的刺激。記錄用藥前電流后，用含SK通道特異性阻斷劑蜂毒明肽\\(100nmol/L\\)的電極外液灌流3min，再次記錄電流，給蜂毒明肽前后的電流相減獲得“蜂毒明肽敏感性電流”，此電流即“IK，Ca”。記錄每個細胞電容，計算電流密度\\(pA/pF\\)=電流\\(pA\\)/電容\\(pF\\)。
1．2．3統計學方法采用SPSS13．0統計學軟件。數據以珋x±s表示，組間數據比較采用Student'st檢驗。P≤0．05為差異有統計學意義。
2、結果
全部犬順利完成實驗，每只犬至少取3個心房肌細胞進行膜片鉗實驗。當鉗制電位為－100mV時，快速心房起搏組心房肌細胞電流密度為\\(－1．7±0．3\\)pA/pF，對照組為\\(－0．7±0．1\\)pA/pF，P＜0．01;+80mV時，快速心房起搏組心房肌細胞電流密度為\\(4．1±0．6\\)pA/pF，對照組為\\(－1．6±0．2\\)pA/pF，P＜0．01。
3、討論
SK通道家族的特性是電壓非依賴性、僅由細胞內的Ca2+激活和可被蜂毒明肽特異性阻斷，蜂毒明肽對SK通道有高度選擇性，對其他離子通道則不敏感。SK通道是細胞內的鈣調控和細胞膜的電活動之間的重要功能鏈接。AF的發生、發展與離子通道表達異常和細胞內的鈣調控失常密切相關。
Li等發現，SK2基因敲除小鼠的心肌細胞動作電位延長，更易于誘發AF。Ellinor等發現，人類1q21位點的KCNN3\\(SK3\\)基因多態性與孤立性AF的發生相關。最近3項動物實驗結果顯示，阻斷SK通道可以中止AF的發作，提示SK通道可能是一種新型的AF相關性離子通道。Tuteja等和Xu等的研究證實，SK1和SK2通道呈“心房選擇性”分布。該特性使SK通道極有可能成為新的“選擇性”治療AF的藥物靶點，即特異性阻斷SK通道的藥物可以有效治療或預防AF，且無其他抗心律失常藥物常見的致室性心律失常的風險。
我們的前期實驗已經證實，慢性AF\\(AF維持階段\\)患者心房肌細胞中IK，Ca電流密度減低、SK1和SK2表達下調。但Nagy等報道，在生理狀態下，大鼠、犬和人心室肌細胞的SK2通道處于失活狀態，對動作電位的復極化過程不產生影響。Ozgen等的研究顯示，短時間\\(3h\\)快速起搏\\(模擬AF早期階段\\)可使兔肺靜脈肌袖細胞IK，Ca電流密度增強，SK2亞型表達增加，但該研究是在離體組織模型上進行的。本研究采用活體犬AF模型，結果顯示IK，Ca電流密度在AF早期階段增強。該結果與Nagy等的研究結果吻合。這說明SK通道在AF的不同時期功能變化不同，即SK通道在AF初始\\(早期\\)階段和維持階段\\(慢性AF\\)呈“矛盾性重構”改變。
綜上所述，SK通道的功能上調是AF初始階段的重要分子機制之一。由此推測，未來開發新型的特異性SK通道阻斷劑，并預防性應用于AF高危人群中，可能大大降低AF的發生率。
