目前，應用神經組織工程學的方法來促進面神經的再生和修復已成為當今研究的新熱點，我們在前期實驗中應用神經干細胞（ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＮＳＣｓ）移植到可吸收的神經導管修復面神經的缺損取得的不錯的效果，但在實驗中發現來源于中樞的髓磷脂相關抑制物 （Ｎｏｇｏ－Ａ，ｍｙｅｌｉｎａｓｓｏｃｉａｔ－ｅｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓＮｏｇｏ），髓磷脂相關糖蛋白 （ｍｙｅｌｉｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＭＡＧ），少突細胞－髓磷脂糖 蛋 白 （ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ－ｍｙｅｌｉｎｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，Ｏｍｇｐ）是阻礙神經再生的重要因素，這些因子都通過共同受體Ｎｏｇｏ受體（Ｎｏｇｏｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＮｇＲ）起作用，因此，我們應用ＲＮＡｉ抑制ＮＳＣｓ中ＮｇＲ的表達來探討修復大鼠面神經缺損。
１材料與方法
１．１材料和試劑
ｐＧＣｓｉ載體、感受態大腸桿菌ＤＨ５α購自上海吉凱公司、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００、ＮｇＲ、ＭＡＰ－２抗體購自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，各種胎牛血清、ＥＧＦ、ｂＦ－ＧＦ購自Ｒ﹠Ｄ公司，ＰＬＧＡ導管購自上海天清生物公司，其規格為內徑０．８ｍｍ，外徑１．２ｍｍ。
１．２方法
１．２．１ＮＳＣｓ培養及鑒定 孕１０ｄ左右的ＳＤ大鼠，取其胚胎海馬組織，進行ＮＳＣｓ的原代培養、３～４ｄ半量換液，５～７ｄ傳代。種植ＮＳＣｓ于涂有多聚賴氨酸的小玻片上，采用甲醛固定，血清封閉，分別加入相應抗體等步驟后在顯微鏡下觀察染色情況。具體步驟見文獻〔１〕。
１．２．２ＮｇＲｓｈＲＮＡ表達載體的構建、擴增及鑒定 根據ｓｈＲＮＡ的設計原則、載體ｐＧＣｓｉ的酶切位 點 以 及ＧｅｎＢａｎｋ中ＮｇＲ的 編 碼 序 列（１２４０７６５０），參考文獻〔３〕合成針對ＮｇＲ編碼區３６０－３８０ｂｐ和１２０５－１２２５ｂｐ（ＡＡＴＣＴＴＣＣＴＧ－ＣＡＴＧＧＣＡＡＣＣＧ）（ＡＡＧＣＣＴＣＡＧＴＡＣＴＧＧＡＡ－ＣＣＣＧ）為小發夾的靶向的ＤＮＡ片段。設計好的發夾送由上海生工有限公司定制合成，將人工合成的ＤＮＡ序列的兩條鏈，進行等濃度的退火結合，９５℃加熱５ｍｉｎ，然后降至室溫，形成具有粘性末端的互補雙鏈，３ｈ后與酶切后ｐＧＣｓｉ載體產物在Ｔ４連接酶作用下連接，轉化大腸桿菌感受態細胞，然后將１５０μｌ已轉化的感受態細胞轉移到瓊脂培養液上，３７℃過夜培養，克隆產物測序鑒定。
１．２．３脂質體介導ＮｇＲｓｈＲＮＡ轉染ＮＳＣｓ按照ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００的說明書進行脂質體轉染。轉染前１ｄ，于六孔板內接種１×１０５細胞，加入１５％ ＦＢＳ的ＤＭＥＭ２ｍｌ進行培養，將２μｇＮｇＲｓｈＲＮＡ質 粒 和４μｌＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００先 分 別 用２５０μｌ不 含 抗 生 素 和 血 清 的ＤＭＥＭ稀釋，后將稀釋的質粒和ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００混合，室溫孵育２０ｍｉｎ。把這５００μｌ混合物加入六孔板的培養液中，來回搖晃以混勻。設立實驗組、空質粒對照組。細胞于３７℃、５％ ＣＯ２的培養箱中繼續培養，轉染６ｈ后更換為含抗生素和血清的ＤＭＥＭ培養液，３ｄ后在熒光顯微鏡下觀察ＧＦＰ的表達，計算其轉染效率。
１．２．４ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ檢測ＮＳＣｓ中ＮｇＲ的表達分別取實驗組和空質粒對照組的ＮＳＣｓ，轉染３ｄ后見明顯熒光，用冰預冷的ＰＢＳ洗２次，加入細胞裂解液裂解抽提蛋白，按照ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ實驗技術操作說明分別進行蛋白定量，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳、轉膜、封閉，及加入羊抗的ＮｇＲ抗體和兔抗羊的二抗進行雜交、洗膜等操作后，把膜與ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ化學發光底物室溫孵育５ｍｉｎ，曝光Ｘ光片，然后顯影定影。
１．２．５經ＮｇＲｓｈＲＮＡ干擾后ＮＳＣｓ的分化干擾后３ｄ把有明顯熒光的ＮＳＣｓ直接接種于涂有多聚賴氨酸的蓋玻片上，置于３５ｍｍ培養皿，待細胞貼壁后加入ＮＳＣｓ的分化培養液，２周后進行干細胞的分化鑒定，用甲醛固定，血清封閉，分別加入ＭＡＰ－２抗體等方法進行神經元的鑒定，以未干擾的ＮＳＣｓ分化作為對照。在ＬｅｉｃａＱＷ３圖像分析軟件下在２００倍視野下進行細胞計數，每組觀察５張蓋玻片，每張蓋玻片觀察６個不重復視野，計算各組神經元占總細胞數的比例，數據以ｘ珚±ｓ表示，應用ＳＰＳＳ１２．０統計軟件，兩組間數據比較采用ｔ檢驗，以Ｐ＜０．０５為差異有統計學意義。
１．２．６干擾后ＮＳＣｓ移植入ＰＬＧＡ管，進行場掃描電鏡觀察干擾后的ＮＳＣｓ生長至培養瓶的７０％～８０％密度后，離心５ｍｉｎ，去除上清液，加入１ｍｌ培養液，吹打后，計數板計數，得到細胞數約為（０．５～１．０）×１０５／ｍｌ，取出細胞懸液１００μｌ加入細胞外基質２００μｌ，形成混合液，將混合液注入培養液浸泡的ＰＬＧＡ管內，將ＰＬＧＡ管置于培養皿中，移入培養箱。種植后４ｈ后發現細胞貼壁后加入干細胞的分化培養液，２周后，送至同濟大學電鏡室進行場掃描電鏡觀察。
２結果
２．１ＮＳＣｓ培養結果
培養７ｄ左右可見數十個乃至數百個細胞組成的神經球，細胞免疫化學結果示Ｎｅｓｔｉｎ陽性，誘導分化可見大量形態各異的神經細胞，這些結果證實了所培養的細胞為ＮＳＣｓ。
２．２重組質粒的構建結果及轉染結果
構建了２個ＮｇＲ－ｓｈＲＮＡ表達載體質粒，分別命名為Ｐ１、Ｐ２，并經測序鑒定證實，所含目的基因序列準確無誤，重組質粒構建成功。
ＮｇＲ－ｓｈＲＮＡ經脂質體介導轉染ＮＳＣｓ，ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ檢測結果：轉染７２ｈ后，脂質體組可抑制ＮｇＲ蛋白的表達，而裸質粒組對ＮｇＲ蛋白的表達無明顯影響（圖１）。轉染７２ｈ后在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞，Ｐ１、Ｐ２、陰性對照組均可見較多細胞表達綠色熒光，初步計算轉染效率為４０％～５０％，各組間差異無統計學意義（圖２）。ＮＳＣｓ轉染后神經元的分化結果：沉默了ＮｇＲ的ＮＳＣｓ，分化２周后向神經元分化的比例明顯高于未轉染組（圖３），神經元比例分別為４６．７９±４．１０、２２．２６±４．５４，差異有統計學意義。
２．３場掃描電鏡觀察種植
ＮＳＣｓ的ＰＬＧＡ管在分化２周后可見導管壁上生長著各種形態的神經細胞（圖4）
３討論
目前，面神經斷傷后的再生與修復仍是一項挑戰性難題。近年來組織工程修復神經缺損已越來越受到重視，我們在前期實驗中應用ＮＳＣｓ移植到可吸收的神經導管修復面神經的缺損取得的不錯的效果，但在實驗中發現來源于中樞的Ｎｏｇｏ－Ａ、ＭＡＧ、Ｏｍｇｐ是阻礙神經再生的重要因素，這些因子都通過共同受體ＮｇＲ起作用，現已經證實它們對損傷后中樞神經的再生具有抑制作用，如果在基因水平下抑制ＮｇＲ的表達，可直接減輕髓磷脂相關抑制物的抑制作用。近２年來發展迅速的小分子ＲＮＡ干擾技術，提供了這種可行性。
ＲＮＡ干擾是指通過人為地引入與內源靶基因具有相同序列的小的雙鏈ＲＮＡ，誘導內源性靶基因降解，達到阻止基因表達的目的，如何干擾ＮｇＲ成為當前研究的重點。以ｓｉＲＮＡ實現基因沉默是將關于髓隣脂相關抑制因子的基礎研究轉化為基因干擾策略，ＮｇＲ被認為是目前的最佳干預靶點。Ｌｉ等將可溶性的大鼠ＮｇＲ１蛋白進行膜內注射，該蛋白融入了大鼠的ＩｇＧ１區，觀察脊髓脊髓胸段半切斷的大鼠脊髓軸突變化。發現經ｓＮｇＲ１－Ｉｇ治療后軸突再生明顯，而且功能明顯的。
Ｋｉｍ等的研究也發現ＮｇＲ基因缺陷小鼠脊髓全部橫斷１４周后行為學評估有了很大改善。在周圍神經損傷修復中，有文獻報道坐骨神經切斷后局部應用ＭＡＧ可以減少損傷促進能夠的恢復，但較少涉及到ＮｇＲ的表達。我們前期實驗應用ＮＳＣｓ移植修復周圍性面神經的損傷，雖然實驗證實有較好的神經修復結果，但由于原代培養的細胞來自于中樞的海馬組織，體內外分化成膠質細胞的比例要大于神經元，髓磷脂相關抑制物的存在也進一步抑制了神經修復的結果。因此我們在本實驗中成功構建了ＮｇＲ－ｓｈＲＮＡ表達載體質粒，并通過穩定的脂質體介導成功轉染ＮＳＣｓ，ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ的結果顯示干擾后ＮＳＣｓ中ＮｇＲ基因的表達較前減弱，轉染后神經元的分化比例也明顯高于轉染前，從而為我們下一步的體內實驗提供更好的神經營養支持。
總之，本研究成功干擾了ＮＳＣｓ中ＮｇＲ的表達，使ＮＳＣｓ向神經元進一步分化，能更有效促進神經軸突的再生，為促進周圍性面神經再生修復提供更好的種子細胞。
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