近年來，隨著我國經濟水平的快速發展和人民生活水平提高，我國居民糧谷類食物攝入量逐年減少，脂肪供能比明顯增加，并有向西方國家膳食結構轉化的趨勢[1],由此帶來一系列健康問題，如高脂血癥、脂肪肝、心腦血管疾病等。因此，研究高脂飲食對機體的影響具有極其重要的意義。長爪沙鼠（以下簡稱沙鼠）亦稱蒙古沙鼠或黑爪蒙古沙土鼠、黃耗子、砂耗子等，屬哺乳綱，嚙齒目，倉鼠科，沙鼠亞科，沙鼠屬，其肝內類脂質含量高，能保持高血脂和高膽固醇水平，血清膽固醇含量極易受飼料膽固醇含量影響，且高膽固醇飲食可導致肝臟脂沉積，對研究高血脂、膽固醇吸收和食源性膽固醇代謝等很具價值。本次實驗旨在研究高脂飲食對沙鼠的病理生理學影響，為脂質代謝紊亂相關疾病的造模提供新思路。
1 材料和方法
1. 1 實驗動物
清潔級成年雄性 Z:ZCLA 長爪沙鼠 48 只，體重（50 ±10）g,浙江省醫學科學院實驗動物中心提供，許可證：【SCXK（浙）2008 -0033】，飼養于浙江中醫藥大學動物實驗研究中心屏障動物實驗設施中【SYXK（浙）2008 -0115】。
1. 2 主要試劑
膽固醇由上海思吉生物制品有限公司提供，3 號膽鹽由杭州微生物試劑有限公司提供，蛋黃粉由浙江省長興縣艾格生物制品有限公司提供，血糖（Glu）、甘油三酯（TG）、膽固醇（CHOL）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、尿酸（UA）、肌酐（CREA）、尿素氮（BUN）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬酸氨基轉移酶（AST）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、總膽紅素（TBil）、淀粉酶（AMS）等診斷試劑盒均由上海申能-德賽診斷技術有限公司提供；低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）診斷試劑盒由上海復星長征醫學有限公司提供；蘇木素和伊紅染料為 Sigma 進口分裝，Masson 染色試劑合由中國福州邁新生物技術有限公司提供。
1. 3 主要儀器設備
日立 7020 全自動生化分析儀，德國 BecrmanAllegra X-15R centrifuge 離 心 機，德 國 MicromSTR120 自動組織脫水機，德國 Microm HM335E 半自動石臘包埋機，德國 LeicaRM 2025 病理切片機，德國 Leica DMLB2 顯微鏡。
1. 4 高脂飼料配制
由 80. 5%的普通飼料、10% 的蛋黃粉、7% 的豬油膽、2%的膽固醇及 0. 5% 的 3 號膽鹽組成。普通飼料和高脂飼料均經浙江省醫學科學院實驗動物中心加工生產。
1. 5 分組及處理
48 只沙鼠適應性飼養 1 周后，隨機分為正常組及模型組，每組 24 只，每組又分 4 周、8 周及 16 周 3個時相點。正常組予普通飼料喂養，模型組予高脂飼料喂養，自由飲水，兩組分別在第 4、8、16 周末 3個時相點各隨機處理沙鼠 8 只。處理前晚起禁食不禁水 18 h,次日上午空腹麻醉下采血，分離血清待用；取部分肝組織立即進行冰凍切片，油紅 O 染色；收集心、肺、肝、胰、腎、脾、小腸（近回盲部）等臟器標本，于 10% 中性甲醛溶液中固定，經脫水、透明、浸蠟、包埋制成組織蠟塊待用。
1. 6 檢測指標
動態觀察兩組沙鼠 3 個時相點體重，全自動生化儀檢測 3 個時相點血清 Glu、TG、CHOL、HDL-C、LDL-C、UA、Cr、BUN、TBil、TP、ALB、ALT、AST、AMS水平，冰凍切片肝組織油紅 O 染色觀察肝臟脂質沉積情況，各臟器石蠟組織切片后常規 HE 染色光學顯微鏡觀察組織病理學變化，Mossan 染色觀察肝組織纖維化程度。
1. 7 統計學方法
計量資料采用均數 ± 標準差（x± s） 表示，以SPSS17. 0 統計軟件進行分析，兩組之間比較采用獨立標本的 t 檢驗，當 P < 0. 05 時表示差異有統計學意義。
2 結果
2. 1 高脂飲食對沙鼠體重的影響
高脂飲食喂養 4 周后，模型組沙鼠體重增加稍快于正常組，但差異無統計學意義（P > 0. 05），至 8周時較正常組明顯增加（P <0. 05），而 16 周時正常組體重略有增加，而模型組基本維持與 8 周同一水平，見表 1.
2. 2 高脂飲食對沙鼠血糖及血脂的影響
模型組沙鼠血糖水平隨高脂飼料喂養時間增加而降低，模型組 16 周時相點較 4 周、8 周時相點顯著降低（P < 0. 05），模型組 16 周時也較正常組 16周時明顯降低（P <0. 01）。
血脂方面，除模型組 4 周時 TG 水平與正常組差異無統計學意義外，模型組 8 周、16 周時的 TG 水平及 3 個時相點的 CHOL、HDL、LDL 水平均較同期正常組顯著增高（P < 0. 01）；高脂喂養 4 周時和 8 周時的血脂水平總體持平，而至 16 周時則較 4 周、8周顯著增高（P <0. 01）。見表 2.
2. 3 高脂飲食對長爪沙鼠肝功能的影響
模型組沙鼠血清 ALT、AST 水平在 4 周時即較同一時相點正常組顯著增高（P < 0. 01），8 周時達到高峰，16 周時 ALT 有所降低、AST 則維持在高水平，均較同一時相點正常組明顯增高（P < 0. 01）。
模型組 TP 水平 8 周時較同一時相點正常組明顯增高（P <0. 01），4 周、16 周時則與正常組差異無統計學意義（P > 0. 05）；隨高脂飲食時間增加模型組沙鼠血清 ALB 水平 8 周時較 4 周時顯著增高，而 16周時則較 4 周、8 周顯著降低； 模型組 球 蛋 白（GLB）、TBil 水平則隨造模時間延長而逐漸增高，而ALB / GLB 則逐漸降低，見表 3.
2. 4 高脂飲食對沙鼠腎功能及血清淀粉酶的影響
高脂喂養 4 周、8 周及 16 周 3 個時相點沙鼠血清 BUN、CREA 水平均與同一時相點正常組差異無統計學（P > 0. 05）；模型組沙鼠血清 UA 水平在 4周、8 周時與正常組差異無統計學，在 16 周時則較同一時相點正常組及模型組 4 周、8 周時相點均顯著增高（P <0. 01）；模型組沙鼠血清 AMS 水平在 4周、8 周時與正常組無統計學差異，在 16 周時則較同一時相點正常組明顯增高（P <0. 01）。見表 4.
2. 5 高脂飲食對沙鼠心、肺、肝、胰腺、脾、腎、小腸等的組織病理學影響
HE 染色光鏡下觀察發現正常組沙鼠心肌纖維排列整齊，高倍鏡下顯示有橫紋，細胞間質較少，內見少量血管及結締組織。模型組 4 周心肌纖維排列仍整齊，胞漿內少量的細小脂肪空泡；至 8 周心肌纖維變性，橫紋不清，模糊，胞漿內可見數量不等脂肪小空泡，間質水腫、血管擴張，少量炎性細胞滲出；16周間質水腫更明顯，炎性細胞滲出有增加，胞漿內脂肪空泡增多，間質內脂肪細胞明顯增加；模型組各時相點間質纖維化不明顯（圖 1）。
HE 染色光鏡下觀察沙鼠正常組肺結構清楚，未見肺泡膈增厚，未見炎細胞浸潤。模型組 4 周時肺結構清楚，肺泡毛細血管充血，肺胞膈略有增厚，伴少量炎癥細胞滲出；至 8 周時肺胞膈增厚較 4 周時明顯；16 周時肺泡結構欠完整，肺泡腔逐漸消失，內可見大量泡沫細胞代替，部分見脂肪肉芽腫（圖 2）。
沙鼠正常組肝臟大體觀察顏色鮮紅，邊緣銳利，表面光滑，質軟而韌；模型組 4 周及 8 周時肝臟體積增大，邊緣變鈍，顏色呈奶油黃，質地較正常組軟且韌性差，觸之似泥塊并有油膩感；至 16 周時肝臟色澤晦暗淡黃色，表面粗糙，質地較正常組稍硬。油紅 O 染色發現正常組各組沙鼠肝細胞胞漿見少量細小的紅染物質，模型組 4、8 周肝細胞內沉積大量被染成紅色的脂肪，至 16 周時染成紅色脂肪的范圍有所減少。HE 染色正常組肝組織結構完整，肝細胞以中央靜脈為中心，向四周放射狀排列，匯管區結締組織略多，其內見小葉間靜脈、小葉間動脈和小葉間膽管斷面。模型組 4 周肝細胞內彌漫脂肪空泡，肝小葉內見少量點狀壞死，無肝細胞氣球樣變，Masson 染色顯示無明顯的竇周纖維化；至 8 周時肝細胞內脂肪空泡增多，肝小葉內散在的壞死灶，肝細胞氣球樣變，竇周纖維化，部分合并門脈周圍纖維化；16 周時肝小葉內壞死灶較 8 周時略有減少，但肝細胞氣球樣變仍明顯，Masson 染色顯示間質纖維化明顯，見橋接纖維化，部分可見假小葉形成（圖3 ~ 5）（ 圖 1 ~ 5 見文后彩插 1）。
HE 染色光鏡下觀察沙鼠胰腺結構正常，外分泌腺腺泡結構清晰，未見炎癥細胞滲出和纖維組織增生，胰島散在分布，內結構清楚。模型組 4 周、8 周時未見明顯異常，16 周時可見部分胰島增大，胰島內內分泌細胞增多（圖 6）。
模型組沙鼠大體觀察脾臟體積較正常組明顯腫大，且隨造模時間的延長而增大明顯。HE 染色光鏡下觀察正常組沙鼠脾臟皮髓分界清楚，脾小體清晰可見。模型組 4 周、8 周皮髓分界清楚，脾小體縮小，紅髓擴大，內可見散在泡沫樣細胞；至 16 周脾小體明顯縮小，紅髓內被大量泡沫樣細胞所代替而擴大（圖 7）。
正常組及模型組沙鼠雙腎大體觀察大小均勻一致。HE 染色顯微鏡下觀察發現皮髓分界清楚，皮質內腎小球清晰可見，內未見毛細血管內皮細胞、系膜細胞增生，未見基質增生，未見腎小管基底膜增生，略有毛細血管充血，腎小管可見少量濁腫變性（由于本實驗未采用灌注固定，故處死取組織過程中可能會出現輕微的缺血缺氧變化，而腎小管對缺血缺氧特別敏感），間質內未見炎癥細胞浸潤，未見纖維細胞增多；模型組各時相點鏡下未見明顯改變（圖 8）。
HE 染色光鏡下觀察正常組沙鼠小腸結構正常，粘膜與粘膜下層向管腔內凸起形成皺襞，粘膜表面大量突起的腸絨毛，絨毛表面可見單層柱狀上皮，間有杯狀細胞，絨毛間的上皮向固有層凹陷形成腸腺，肌層由內環行和外縱行二層平滑肌組成，外膜為一層纖維膜。模型組各時相點小腸粘膜鏡下未見明顯改變（圖 9）（圖 6 ~9 見文后彩插 2）。
3 討論
高脂飲食給機體帶來的損傷一直是諸多學者關注的熱點，大量研究證明，高脂飲食可導致血脂紊亂和肥胖，從而誘導機體免疫功能紊亂、血清炎癥介質、細胞因子失衡以及細胞表面受體表達異常，而這些與機體炎癥反應密切相關。它產生危害主要通過 2 條途徑：一是脂質在組織內蓄積所導致的細胞毒性；二是高脂飲食引發血脂紊亂介導的炎癥反應和自身免疫反應[2].本次研究發現高脂飲食可對沙鼠產生多種病理生理學影響。
高脂飲食對沙鼠血脂的影響十分明顯，隨造模時間的增加，沙鼠高脂血癥逐漸嚴重，TG、CHOL、HDL、LDL 水平均越來越高，尤其是 LDL 水平在 16周時是 4 周、8 周時的 4 ~ 5 倍。本研究還觀察到，隨造模時間延長，血清 TG 的水平也逐漸增高，同時出現高 CHOL 血癥和高 TG 血癥，這與我們以往觀察到給大鼠高脂飲食早期（4 周）血清 TG 有增高而長期喂養（8 周、12 周）后血清 TG 往往不高甚至降低[3]的表現不同；提示沙鼠對膳食脂質的血脂變化模式可能與人類的反應模式更接近，可能更適用于高脂血癥研究的模型選擇。
高脂飲食可造成沙鼠肝組織大量脂質沉積，本研究顯示造模 4 周時肝細胞脂肪變已超過 66% 達到重度；8 周時在脂肪變的基礎上，肝組織炎癥、壞死，肝細胞氣球樣變及間質纖維化明顯，16 周時間質纖維化加重，出現早期肝硬化表現，部分沙鼠肝組織有假小葉形成；同時這些變化伴隨著肝功能的改變，高脂喂養使沙鼠 ALT、AST 及 TBil 或早或晚較正常組均顯著升高，且 16 周時模型組 ALB 及 A/G 較前期（4 周與 8 周） 出現了明顯下降，ALB 全部由肝臟合成，這提示肝臟的合成功能受到了影響，可見高脂飲食沙鼠肝細胞損傷的發生，是非酒精性脂 肪 性 肝 病 （ non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）的典型表現。NAFLD 被認為是代謝綜合征在肝臟的一種表現[4],大多數 NAFLD 患者不表現出任何癥狀，隨著疾病的進展可出現肝臟脂肪變性、非 酒 精 性 脂 肪 性 肝 炎 （ non-alcoholicsteatohepatitis,NASH）、肝硬化、肝細胞肝癌等[5].
本研究的沙鼠模型涵蓋了 NAFLD 疾病譜從非酒精性脂肪肝到肝硬化的各個階段，是 NAFLD 研究的良好模型。根據中華醫學會肝臟病學分會的“非酒精性脂肪性肝病診療指南”中病理學診斷標準[6],本模型 16 周時肝纖維化分期為 S4（高度可疑或確診肝硬化）的有 5 例，S3（橋接纖維化）3 例，Masson 染色可明顯顯示部分沙鼠肝臟出現了假小葉，且均伴有脾大，為肝硬化的典型表現，而我們在以往的研究采用單純高脂飲食喂養大鼠僅可誘導明顯的肝纖維化表現，且實驗周期達 24 周[7],文獻報道也尚未見單純高脂飲食誘導的大、小鼠肝硬化模型，這說明沙鼠用于非酒精性脂肪性肝炎肝硬化的研究有著廣泛的前景。另外，本實驗還發現 16 周時沙鼠血尿酸水平明顯升高，已有研究證明高尿酸血癥和NAFLD 之間存在關系[8],因此沙鼠可能還是研究高脂飲食誘導的 NAFLD 與高尿酸血癥的相關性的良好模型。高尿酸血癥是嘌呤代謝障礙引起的代謝性疾病，和高脂血癥具有相關性，目前已有酵母膏+ 乙胺丁醇灌胃建立的小鼠高尿酸血癥模型[9]、高酵母飼料加腺嘌呤灌胃并適時給予氧嗪酸鉀乳懸液皮下注射所復制的大鼠慢性高尿酸血癥模型[10]、次黃嘌呤腹腔注射聯合尿酸氧化酶抑制劑皮下注射復制的小鼠高尿酸血癥模型[11]等，本研究單用高脂飲食喂養即使沙鼠血尿酸顯著升高，這為高尿酸血癥的動物模型復制提供了新方法，或許能為高尿酸血癥的發病機制提供新的思路。
本實驗還觀察到模型組沙鼠在 16 周時血糖較1飲食喂養的大鼠會產生胰島素抵抗，進一步導致血糖升高[12,13].但同樣有研究觀察到高脂飲食喂養12 周可使沙鼠血糖明顯升高[14],因此高脂飲食對沙鼠血糖的影響尚待進一步研究。本研究觀察到16 周時模型組沙鼠胰腺組織可見部分胰島增大，胰島內內分泌細胞增多，這表明沙鼠可能存在胰腺分泌胰島素的異常，但血糖卻反而降低，同時體重也未見明顯增加，如果今后進一步實驗能驗證上述這一特點，或許說明沙鼠體內存在某一種機制能夠防止長期高脂飲食誘導的糖尿病的發生，進一步研究這一現象或許能為以后糖尿病的治療提供新的思路。
本研究通過 HE 染色光鏡下未觀察到胰腺明顯的充血、水腫、壞死等病理改變，但血清淀粉酶水平在 16 周時較正常組顯著增高。高脂血癥是急性胰腺炎的常見病因之一，其機制目前尚未完全清楚，可能與其激活胰蛋白酶，消化胰腺腺泡引起胰腺的自身消化；或造成胰腺的微循環障礙，胰液分泌受阻等有關[15].進一步研究可以通過電鏡觀察胰腺超微結構，探討單純高脂飲食與血清淀粉酶升高及高脂血癥性急性胰腺炎之間的關系，也可以通過延長高脂飲食喂養時間觀察是否可以誘導出高脂血癥性急性胰腺炎模型。
高脂飲食的喂養使模型組沙鼠逐漸出現肺胞膈增厚，炎癥細胞滲出，肺泡腔消失，代以大量泡沫細胞及脂肪肉芽腫形成，說明高脂飲食會導致肺損傷，并介導炎癥反應的發生。高脂飲食喂養的小鼠肺組織亦可觀察到和本實驗類似的病理學改變[2],已有學者在高脂飲食喂養的大鼠模型中觀察到肺纖維化[16],但本模型未觀察到明顯的肺纖維化的發生。高脂飲食喂養的沙鼠在 16 周還出現了明顯的心肌脂肪變性和心肌損傷，這說明該模型可能可以用于高脂血癥相關的心肌損傷的研究。但本研究HE 染色光鏡下未觀察到腎組織和腸粘膜的病理改變，血清肌酐、尿素氮也未見異常。
本研究提示，高脂飲食可誘導良好高脂血癥、非酒精性脂肪性肝炎肝硬化沙鼠模型，并且高脂飲食喂養的沙鼠可能是高脂血癥相關的高尿酸血癥、肺損傷及心肌損傷等的良好模型。
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