呼 吸 道 合 胞 病 毒 \\(respiratory syncytial virus,RSV\\)是引起 5 歲以下嬰幼兒下呼吸道感染的主要病原[1]. 嬰幼兒時期 RSV 感染與兒童持續喘息和氣道高反應性\\(airway hyper-responsiveness,AHR\\)密切相關[2]. Thorburn 等[3]報道超過 40%的需要收入 ICU 的重癥 RSV 感染患兒合并下呼吸道細菌感染, 且以能產生脂多糖\\(lipopolysaccharide,LPS\\)的革蘭陰性菌為主,提示合并細菌感染,特別是革蘭陰性菌,可能加重 RSV 感染. LPS 作為革蘭陰性菌主要成分,在其致病性方面發揮重要作用.本課題組前期結果顯示 LPS可通過 TLR4 \\(Toll-like receptor 4,TLR4\\) 上調 RSV感染后上皮細胞 IL-6 表達水平[4],但在體內 LPS 對RSV 感染的影響還不清楚. 本研究擬建立 RSV 感染后 LPS 再刺激的小鼠動物模型, 觀察其氣道炎癥及AHR,并探討氣道炎癥及 AHR 產生機制,為進一步尋找 RSV 感染后繼發革蘭陰性菌感染的治療靶點奠定理論基礎.
1 材料與方法
1.1 病毒準備 呼吸道合胞病毒 A2 標準株來源于北京兒童醫院病毒實驗室, 將其接種于 Hep-2 單層細胞,37 ℃條件下培養于含 10%胎牛血清的 DMEM 培養基中,細胞出現 90%以上病變時刮起貼壁細胞,收集混懸液,12 000 r/min 4 ℃離心 10 min, 收集上清,分裝病毒液,-80 ℃保存備用, 空斑實驗測定病毒滴度. 未接種病毒的細胞培養液為病毒對照液.
1.2 實驗動物及分組 SPF 級 6~8 周齡雌性 Balb/c 小鼠由重慶醫科大學實驗動物中心提供, 飼養于 IVC級環境中,獨立呼吸通道,滅菌飼料及飲水喂養,所有動物實驗操作獲得重慶醫科大學倫理委員會同意,遵守《實驗動物管理條例》. 將小鼠隨機分為 4 組. 對照組: 病毒對照液 100 μl 滴鼻后,50 μl PBS 連續 3 d滴鼻;LPS 組:病毒對照液 100 μl 滴鼻后,10 μg LPS\\(Escherichia coli 055:B5,Sigma\\)/50 μl PBS 連續 3 d滴鼻;RSV 組:病毒液 100 μl 滴鼻,相當于滴入病毒7×106PFU,50 μl PBS 連續 3 d 滴鼻;RSV+LPS 組:病毒液 100 μl 滴鼻后,連續 3 d 滴鼻給 10 μg LPS/50 μlPBS. 在首次處理后第 7 天收取肺組織、肺泡灌洗液標本.
1.3 病毒拷貝數檢測 按 BioTake 快速全 RNA 試劑盒說明書提取小鼠肺組織總 RNA,紫外分光光度計定量后,TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit 逆轉錄試劑盒,按說明進行逆轉錄. 取 2 μl cDNA 用探針法檢測病毒拷貝數. 采用 TaqMan Universal PCR MasterMix\\(Applied Biosystems\\), 程序為:50 ℃ 2 min,95 ℃10 min, 95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,39 個循環. 引物、探針、質粒參考文獻設計[5],均由華大基因合成\\(表 1\\).
1.4 肺 泡 灌 洗 液 \\(bronchoalveolar lavage fluid,BALF\\) 中炎癥細胞總數及分類計數 成功氣管插管后,4 ℃預冷 PBS 3 ml 灌洗肺臟,0.5 ml/次,共 6 次,回收率大于 90%. 灌洗液于 4 ℃ 2 500 r/min 離心 5 min后,收集上清,-80 ℃保存備用. 1 ml PBS 重懸細胞沉淀,顯微鏡下計數,剩余液體再次離心后將細胞沉淀涂片,快速瑞姬氏染液\\(南京建成科技有限公司\\)染色后,光學顯微鏡下分類計數. 計數時為實驗者隨機選取組別及小鼠編號后從 1 開始編號, 編號完成后,與另一實驗者分別計數,2 人計數平均值為所得細胞計數及分類計數結果.
1.5 肺組織病理切片 將小鼠麻醉處死后,取出肺組織,置 4%甲醛固定 24 h 后,行沖水、脫水、組織透明、浸蠟、包埋.組織蠟塊切片后行 HE 染色,光鏡下觀察肺組織受損及炎癥浸潤情況,根據文獻[6]分別進行細支氣管周圍炎癥、血管周圍炎癥及肺泡炎癥病理評分. 評分時為實驗者隨機選取組別及小鼠編號后從 1開始編號,編號完成后,與另一實驗者分別評分,2 人評分平均值為所得病理評分結果.
1.6 氣道高反應性測定 小鼠氣道高反應性在清醒狀態下檢測, 通過體積描述法檢測小鼠自主呼吸.Baseline 為小鼠在未進行霧化給藥前,體積描記儀器\\(EMKA\\)記錄氣道阻力記錄的 Penh 值. 待檢測的小鼠用生理鹽水或不同質量濃度 \\(3.125、6.25、12.5、25及50 mg/ml\\)的乙酰甲膽堿\\(Sigma\\)霧化 3 min,休息 2 min,然后記錄 Penh 值,連續記錄讀數 5 min.氣道高反應性曲線表示為在不同質量濃度乙酰甲膽堿霧化后的氣道阻力\\(enhanced pause, Penh\\),Penh=PEP/PIF×Pause.
1.7 肺 組 織 TRIF、 MyD88 蛋 白 表 達 檢 測 采 用Western blot 方法檢測肺部 TRIF、 MyD88 蛋白表達.提取肺組織總蛋白,按凱基全蛋白抽提試劑盒說明書操作,BCA 法蛋白定量. 80 μg 蛋白上樣, 經 10%SDS -PAGE 凝膠電泳 , 轉膜 , 室溫封閉 1 h, 一抗\\(TRIF-1 ∶500,MyD88-1 ∶200,β-action-1 ∶10 000\\)\\(TRIF -Abcam,MyD88 -Santa Cruz Biotechnology,β -action-Epitomics\\)4 ℃孵育過夜 ,二抗 \\(1∶10 000\\)\\(聯科生物\\)室溫孵育 1 h,ECL 發光液\\(Bio-rad\\)進行蛋白信號檢測.
1.8 細胞因子水平檢測 ELISA 方法檢測小鼠 BALF中 KC、IFN-γ、IL-1β、IL-6 細胞因子水平, 操作按試劑盒\\(KC--R&D,IFN-γ、IL-1β、IL-6-四正柏\\)說明書進行.
1.9 統計學分析 統計學分析采用 Graphpad Prim5.03 進行數據統計分析,采用單因素方差分析\\(One-way ANOVA\\), 先進行方差齊性 Bartlett's test 檢驗,方差齊者組間差異使用 Newman-keuls 檢驗 ,方差不齊者組間差異使用 Kruskal-Wallis test 檢驗;P<0.05為差異有統計學意義.
2 結果
2.1 病 毒 拷 貝 數 RSV +LPS 組 \\(1.36 ×105±6.13 ×104copies RSV-RNA/ml\\)與 RSV 組 \\(1.06×105±5.38×104copies RSV-RNA/ml\\) 之間病毒拷貝數差異無統計學意義.
2.2 LPS 對 RSV 感染小鼠肺部炎癥的影響2.2.1 BALF 中細胞總數及分類計數 LPS 組 、RSV組、RSV+LPS 組 BALF 中細胞總數較對照組均明顯增多\\(P 均<0.05\\),且 RSV+LPS 組細胞總數增多最明顯. LPS 組以中性粒細胞為主,RSV 組以淋巴細胞為主,RSV+LPS 組以中性粒細胞為主\\(圖 1\\).
2.2.2 肺組織病理改變 對照組小鼠肺泡結構清楚,壁薄無充血,肺間質無炎癥細胞浸潤.LPS 組、RSV 組和 RSV+LPS 組均存在彌漫性肺泡間隔增厚與肺泡壁破壞,氣管周圍、血管周圍不同程度炎癥細胞浸潤,3組氣管周圍、血管周圍、肺泡間隔病理評分差異無統計學意義\\(圖 2\\).
2.3 氣道高反應性\\(Penh 值\\) LPS 組較對照組無氣道高反應性,RSV 組、RSV+LPS 組氣道高反應性較對照組明顯增高\\(P 均<0.001\\). RSV+LPS 組氣道高反應性較 RSV 組增高,但差異無統計學意義\\(圖 3\\).
2.4 TRIF 與 MyD88 蛋白表達 LPS 組肺組織中TRIF 蛋白表達較對照組變化不明顯;RSV 組中 TRIF點蛋白表達較對照組稍增高,差異無統計學意義;RSV+LPS 組 TRIF 蛋白表達較對照組明顯增高 \\(P <0.01\\);RSV+LPS 組較 LPS 組 、RSV 組 TRIF 表達升高,差異無統計學意義.各組肺組織中 MyD88 蛋白表達無差異\\(圖 4\\).
2.5 細胞因子檢測 RSV 組小鼠 BALF 中以 IFN-γ升高為主\\(P<0.01\\),RSV+LPS 組以 KC 升高為主\\(P<0.05\\). 各組 BALF 中 IL-6、IL-1β 表達無明顯變化\\(圖 5\\).
3 討論
全球范圍內每年約有 3 380 萬嬰幼兒因RSV 感染而致下呼吸道感染, 其中 340 萬患兒需要住院治療,6.6~19.9 萬患兒死亡[7]. 40%~50%的因感染 RSV而住院的患兒會發展成為持續性喘息[8],特別是重癥RSV 肺炎患兒, 發展為反復喘息及成為兒童哮喘的風險更高[9]. Thorburn 等[3]報道超過 40%的需要收入ICU 的重癥 RSV 感染患兒都伴隨下呼吸道細菌感染. RSV 感染伴隨繼發性細菌感染因其對氣道炎癥的影響可能會加重喘息的嚴重性[10]. 本研究中,LPS刺激 RSV 感染小鼠后,氣道炎癥與 AHR 均增加,與課題組前期的體外研究結果[4]及臨床現象一致.
病毒進入宿主,利用宿主細胞進行復制、擴增,對宿主造成直接損傷.Zhao 等[11]報道博卡病毒可以引起下呼吸道感染,但是只有博卡病毒高拷貝復制的患者才出現臨床表現,提示高拷貝病毒復制和疾病嚴重性存在相關性. 且本課題組前期研究也發現 RSV 病毒復制可能與感染后氣道炎癥及 AHR 相關[12]. 本研究中 RSV+LPS 組較 RSV 組病毒拷貝數無增高,提示病毒高拷貝可能不是 RSV+LPS 組氣道炎癥及 AHR 較RSV 組加重的原因.
中性粒細胞是最先抵達炎癥部位的天然免疫細胞,進行病原清除的同時也可引起炎癥反應[13]. 本研究中,LPS 刺激 RSV 感染小鼠后使其 BALF 中炎癥細胞由淋巴細胞為主轉變為中性粒細胞為主. 同時,RSV+LPS 組小鼠 AHR 也較 RSV 組有增高, 提示中性粒細胞可加重 AHR,與研究報道 RSV 感染重癥患兒氣道以中性粒細胞為主[14]相符.
KC 是小鼠中性細胞最重要的化學趨化因子之一,它的功能相當于人類的 IL-8. 作為中性粒細胞強效趨化因子及化學激活劑,IL-8 可引起中性粒細胞向呼吸道遷移、活化[15],是重癥 RSV 肺炎的危險因素之一[16]. 本研究中,RSV 組小鼠 BALF 中 IFN-γ 表達明顯增加,與課題組前期報道 IFN-γ 表達可增加RSV 感染小鼠氣道炎癥及 AHR 相符[17]. RSV+LPS 組BALF 中以 KC 為主,提示 LPS 改變了單純 RSV 感染BALF 中以 IFN-γ 為主的細胞因子表達,增加了 KC表達,BALF 中細胞因子水平與細胞計數及分類計數結果一致. 其可能機制是:LPS 做為革蘭陰性菌的致病成分可促進中性粒細胞趨化因子 KC 在肺組織中的表達,從而肺泡灌洗液中中性粒細胞明顯增多. 過多的中性粒細胞所引起的炎癥反應可以引起組織損傷[13],從而使 RSV+LPS 組小鼠氣道炎癥及 AHR 較RSV 組增強.
Toll 樣受體家族 \\(Toll-like receptor,TLRs\\)作為天然免疫的重要組成部分,通過識別多種病原微生物的病原分子相關模式 \\(pathogen molecular associatedpattern,PMAP\\)在急性炎癥反應和信號轉導方面起重要作用[18]. RSV 感染 9HTEo 氣道上皮細胞后 TLR1-10 mRNA 水平均上調[4]. TLRs 通過下游髓樣分化因子 88\\(MyD88\\)依賴途徑和 MyD88 非依賴途徑\\(主要是 TRIF\\)進一步發揮作用.RSV 的免疫反應特別是天然免疫與病毒成分 F 蛋白、G 蛋白關系密切, 而目前研究較清楚的是 F 蛋白通過 TLR4 發揮作用.文獻報道正常氣道上皮細胞對 LPS 暴露無反應, 當 RSV 感染該氣道上皮細胞后,TLR4 出現膜表達增高而胞內表達降低的重新分布現象[19-20].因此,在本研究中可能由于 RSV 感染后上皮細胞膜 TLR4 表達升高對 LPS的耐受機制被破壞,TRIF-KC 通路活化,下游炎癥因子水平上調. 另一方面,LPS 或 RSV 干預后 MyD88水平存在動態變化, 本研究僅對感染后第 7 天進行研究,未檢測到 MyD88 升高.以上可能是 LPS 組、RSV+LPS 組肺組織中 TRIF 存在表達差異而 MyD88 變化不明顯的原因.
綜上所述,RSV+LPS 組小鼠氣道炎癥及 AHR 較RSV 組增加可能是通過 TRIF-KC 途徑募集中性粒細胞,造成肺組織損傷所致. 在環磷酰胺處理的免疫低下的小鼠中,RSV 通過 TRIF-IFN-γ 引起氣道炎癥及 AHR[17],而在 LPS 刺激 RSV 感染小鼠后,也是通過增強 TRIF 來增加氣道炎癥及 AHR,提示 TRIF 在RSV 導致的炎癥中扮演重要角色, 但是它是如何引起下游不同細胞因子的表達, 從而加重氣道炎癥及AHR 需要進一步研究.
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