血管的形態和功能亦隨年齡的增長發生各種退行性變化,主要表現為管壁增厚、血管增生導致管腔變窄、彈性纖維減少、內皮細胞功能紊亂、血管硬度增加等。在血管老化進程中,血管平滑肌上的各種離子通道也將發生增齡性變化。其中,大電導鈣激活鉀通道\\( large-conductance calcium-activated K+channels,BKCa\\) 在血管平滑肌細胞的膜電位及血管張力維持中起著重要的負反饋調節作用,因此它在衰老及疾病中的變化也受到廣泛關注。血管平滑肌細胞上的 BKCa通道由 α 亞基和 β1亞基構成。其中4 個 α 亞基構成孔道結構,而 β1亞基則是重要的功能調控單位。前期研究中我們發現,衰老可導致大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞 BKCa通道活性下降,表現為電壓敏感性和鈣敏感性下降、開放時間縮短而關閉時間延長。然而,大鼠腸系膜動脈 BKCa通道 α 和 β1亞基的分子表達隨年齡增長究竟發生怎樣的變化尚未見文獻報道。因此,本研究擬選用青年、中年和老年大鼠,探討其腸系膜動脈平滑肌細胞 BKCa通道組成亞基的增齡性變化特征,以期為衰老導致的外周阻力動脈的舒縮功能改變尋找分子依據。

1、 材料與方法

1. 1 實驗動物與分組

2 月齡健康雄性 Wistar 大鼠購自北京維通利華實驗技術有限公司,分別飼養至 4 ~ 5 月齡\\( 青年組\\) 、15 ~ 16 月齡\\( 中年組\\) 和 22 ~ 24 月齡\\( 老年組\\) ,各組 18 只。國家標準嚙齒類動物飼料,分籠飼養,自由飲食,溫度維持在 22 ~ 24℃,相對濕度40% ~ 60% ,晝夜節律人工控制光照\\( 光照時間為6: 00-18: 00\\) 。

1. 2 主要藥物及溶液配制

anti-KCa1. 1 \\( BKCa\\) 和 anti-sloβ1\\( KCNMB1\\) 購自 Alomone Labs\\( 以色列\\) ; 辣根過氧化物酶標記羊抗兔 IgG 購自 Proteintech Group\\( 美國\\) ; β-actin \\( R-22\\) : sc-130657 購自 Santa Cruz\\( 美國\\) ; 去甲腎上腺素\\( norepinephrine,NE\\) 、BKCa通道選擇性阻斷劑Iberiotoxin\\( IbTX\\) 、Hepes、EDTA 均購自 Sigma \\( 美國\\) ; NaCl、KCl、MgCl2、Glucose、NaHCO3等購自北京化學試劑公司; 肝素鈉購于北京東勝泰博科技有限公司。Krebs 液成分:131. 5 mmol/L NaCl,5 mmol/LKCl,1. 2 mmol / L NaH2PO4,1. 2 mmol/L MgCl2,2. 5mmol / L CaCl2,11. 2 mmol/L Glucose,13. 5 mmol/LNaHCO3,0. 025 mmol/L EDTA,持續充氧\\( 95% O2~5% CO2\\) ,pH =7. 4。

1. 3 大鼠心血管反應性測定

青年組、中年組和老年組各選取 6 只,進行股動、靜脈插管手術。術后 24 h,動物恢復良好,自由飲水進食,在清醒狀態下進行基礎血壓測試。

1. 4 離體血管環制備及張力測定

另選取每組各 6 只大鼠進行腸系膜動脈血管環張力測定和免疫組織化學實驗\\( 見下文\\) 。大鼠腹腔麻醉后斷頭處死,迅速打開腹腔取腸系膜動脈,在 4℃ Krebs 液中剔除血管壁周圍脂肪和血管分支并用平頭針來回穿插去除內皮,制成長 4 mm血管環,進行血管收縮張力測定。先用 120 mmol/LKCl 刺激血管收縮,以凈收縮幅度作為 100% 最大收縮,并用乙酰膽堿\\( Ach\\) 檢測內皮完整性。之后分別再給予去甲腎上腺素\\( 10- 9~ 10- 5mol / L\\) 和 IbTX\\( 10- 7mol / L\\) 刺激血管環,觀察各組血管張力及反應性的變化。

1. 5 蛋白免疫印跡分析

每組選取6 只大鼠進行腸系膜動脈 BKCa通道 α和 β1亞基蛋白免疫印跡分析。大鼠麻醉斷頭,分離出腸系膜動脈并除去脂肪,立即投入液氮中暫存,之后轉入 -80℃冰箱保存。稱取100 mg 組織,迅速加入500 μL RIPA 裂解液,用勻漿器在冰水浴中勻漿 10次,每次勻 4 ~5 s,間隔 4 ~5 s。將勻漿液于 4℃以13000 × g 離心 30 min,取上清液待測。按照常規操作進行蛋白濃度的測定、電泳樣品制備、聚丙烯酰胺凝膠\\( SDS-PAGE\\) 電泳\\( 上樣量每孔 40 ~ 50 μg 蛋白\\) 、轉膜\\( BKCaα 亞基 300 mA 恒流 1. 5 h; BKCaβ1亞基250 mA 恒流 50 min\\) 、5% BSA 封閉 2 h。加入用 0. 01 mol/L TBST 稀 釋 的 一 抗[anti-KCa1. 1\\( BKCa\\) ,1∶ 300; anti-sloβ1\\( KCNMB1\\) ,1∶ 200;β-actin\\( R-22\\) ∶ sc-130657,1∶ 300],室溫脫色搖床上搖動孵育1 h,4℃孵育過夜; 0. 01 mol/L TBST 漂洗三次,加入用辣根過氧化物酶標記羊抗兔 IgG[1∶ 16000\\( BKCaα 亞基\\) ; 1∶ 2000\\( BKCaβ1亞基\\) ; 1∶ 4000\\( β-actin\\) ]孵育1 h。免疫蛋白活性由增強化學發光法檢測,并采用 Quantity One 軟件進行半定量分析。

1. 6 統計學分析

所有結果均以 x ± s 表示,應用 SPSS 17. 0、GraphPad Prism 5 進行數據統計分析,青年組、中年組和老年組之間比較采用單因素方差分析,P <0. 05 為差異有顯著性。

2、 結 果

2. 1 增齡對大鼠體重、心臟重量及基礎血壓的影響

大鼠體重隨增齡顯著增加,而心臟重量三個年齡組間差異無顯著性。因此,心臟\\( mg\\) /體重\\( g\\) 比值隨年齡呈明顯下降。清醒、在體動脈血壓測試顯示,與青年組大鼠相比,中年組和老年組大鼠收縮壓明顯增高,且老年組顯著高于中年組; 舒張壓則隨年齡增加表現為下降,中年組和老年組均顯著低于青年組,但中年組與老年組間差異無顯著性。脈壓與收縮壓變化相似,老年組 > 中年組 > 青年組。三組間心率無明顯差異\\( P >0. 05; 表1 和圖1\\) 。

2. 2 增齡對大鼠腸系膜動脈血管收縮特性的影響

2. 2. 1 高鉀誘發的腸系膜動脈收縮反應 KCl\\( 120 mmol/L\\) 可誘發各年齡組腸系膜動脈收縮,青年、中年和老年組大鼠的最大收縮張力\\( Kmax\\) 分別為 1. 43 ±0. 07 g、1. 38 ±0. 06 g 和 1. 36 ±0. 05 g,三組之間差異無顯著性\\( P >0. 05\\) 。

2. 2. 2 增齡對去甲腎上腺素誘發的腸系膜動脈收縮反應的影響 去甲腎上腺素\\( 10- 9~ 10- 5mol /L\\) 可誘發各組腸系膜動脈收縮,并呈濃度依賴性收縮\\( 圖 2\\) 。與青年組相比,中年組和老年組腸系膜動脈對去甲腎上腺素的最大收縮反應依次下降。引起 50%最大收縮反應的去甲腎上腺素濃度的負對數\\( pD2\\) 分別是 5. 85 ± 0. 04\\( 青年組\\) ,5. 47 ±0. 04\\( 中年組\\) 和 5. 34 ± 0. 05\\( 老年組\\) ,提示增齡導致大鼠腸系膜動脈對去甲腎上腺素的敏感性降低。

2. 2. 3 增齡對 IbTX 誘發的腸系膜動脈收縮反應的影響 BKCa通道特異性阻斷劑 IbTX\\( 10- 7mol /L\\) 可誘發大鼠腸系膜動脈收縮,與青年組相比\\( 28. 6% ±3. 6% Kmax\\) ,中年組和老年組大鼠血管收縮反應明顯降低\\( 18. 2% ± 2. 4% Kmax,8. 3% ±1. 1% Kmax\\) \\( P < 0. 05\\) 。提示隨年齡增長,BKCa通道在血管基礎張力維持中的貢獻率下降\\( 圖 3\\) 。

2. 3 增齡對大鼠腸系膜動脈 BKCa通道 α 和 β1亞基表達的影響分別采用 α 和 β1亞基的特異性抗體可以檢測到 125 kDa\\( α 亞基\\) 和 28 kDa\\( β1亞基\\) 的蛋白表達。與青年組相比,中年組和老年組 α 和 β1亞基表達均顯著下降; 與中年組相比,老年組 β1亞基顯著下降\\( P <0. 05\\) ,而 α 亞基卻差異無顯著性\\( P >0. 05\\) 。因此,β1/ α 隨增齡呈現顯著性下降 \\( P <0. 05; 表 2 和圖 4\\) 。此結果提示,增齡可誘發腸系膜動脈 BKCa通道 α 和 β1亞基顯著下降,但 β1下降較 α 亞基更為顯著。

3、 討論

本研究以青年組、中年組和老年組大鼠的腸系膜動脈為研究對象,首次報道了其平滑肌細胞 BKCa通道 α 亞基和 β1亞基蛋白表達隨增齡出現非 1∶ 1下降的現象,β1亞基下調較 α 亞基更為顯著。

在增齡所致的眾多組織器官的退行性變中,血管衰老是人體衰老的關鍵始發因素。血管老化加快了機體衰老的進程,不僅容易進展為動脈粥樣硬化,影響中樞和器官的供血功能以及心臟功能,而且還易誘發多種內臟疾病的發生,例如冠心病、心肌梗死、腦出血、腎性高血壓、腎功能衰竭等。

衰老導致的動脈硬化,使收縮壓顯著升高,舒張壓下降、不變或輕度升高,從而使脈壓顯著增大。因此,有研究表明脈壓對心血管疾病的預測性更強,是心血管疾病發生的強預測因子,預測效果明顯強于收縮壓和舒張壓。本研究的在體血壓監測結果顯示中年組和老年組大鼠基礎收縮壓和脈壓均顯著高于青年組,且老年組又較中年組顯著增高,均符合血壓的增齡性變化特點。此結果表明本實驗中所建立的增齡大鼠模型成功。

去甲腎上腺素是一種血管收縮劑,它通過與血管平滑肌上的 α 腎上腺素能受體結合而發揮生物學效應。有研究表明,增齡可導致血管平滑肌上 α腎上腺素能受體數量下降,從而使血管對去甲腎上腺素的敏感性下降,導致血管收縮幅度下降; 但亦有研究表明增齡并不會影響 α 腎上腺素能受體的數量,血管收縮幅度降低是因為血管管壁結構改變所致。本實驗發現,去甲腎上腺素誘發腸系膜動脈收縮,并呈濃度依賴性。而隨著年齡的增加,大鼠腸系膜動脈對去甲腎上腺素的敏感性\\( pD2\\) 和最大收縮反應都顯著降低。

BKCa通道在血管平滑肌細胞上分布廣泛且表達密度最高,是細胞運載外向電流的優勢通道,在小動脈肌源性緊張和血管平滑肌舒縮調節中具有重要意 義。BKCa通道的門控機制表現為對胞內[Ca2 +]i 的敏感性和對膜電位的依賴性,因此,在膜去極化和細胞外 Ca2 +內流導致肌漿網上的 Ryanod-ine 受體的 Ca2 +釋放時 BKCa通道被激活,從而使細胞膜超極化,繼而通過抑制 L 型鈣通道,降低細胞內 Ca2 +濃度,引起平滑肌舒張,呈現出一種負反饋調節機制。腸系膜動脈為機體主要的外周阻力血管,其舒縮功能對血壓起至關重要的作用。為探討 BKCa通道在腸系膜動脈基礎張力維持中隨增齡出現的變化,我們進行了離體去內皮血管環張力測定實驗。實驗發現,BKCa通道特異性阻斷劑 IbTX\\( 10- 7mol / L\\) 可誘發各組腸系膜動脈張力增加,幅度為青年組 > 中年組 > 老年組。此結果提示隨年齡增長,BKCa通道在維持血管基礎張力中的貢獻率顯著下降,這也是增齡導致血管張力增高和外周阻力增大的重要原因。

血管平滑肌上的 BKCa通道由構成孔道結構的α 亞基和具有調控功能的 β1亞基構成。β1亞基能增強 BKCa通道的 Ca2 +敏感性和電壓敏感性。有研究發現,β1亞基敲除的小鼠平滑肌細胞上 BKCa通道與鈣火花失耦聯導致細胞膜去極化、血管收縮、血壓升高和左心室肥厚。另外,β1亞基敲除的小鼠腦動脈平滑肌細胞的 BKCa通道表現出對 Ca2 +的敏感性降低,腦動脈的舒張能力下降。有關血管增齡變化的研究報道,某些血管床隨年齡增長可出現 BKCa通道功能和表達的下降,如在大鼠和人類的冠狀動脈,BKCa通道 α 亞基蛋白表達下降,且在轉錄水平發現 β1亞基與 α 亞基表達平行下降; 但是肺動脈和腦動脈平滑肌細胞 BKCa通道表達無顯著性變化。這提示增齡對血管平滑肌細胞BKCa通道的影響是具有組織特異性的。

我們前期采用膜片鉗內面向外單通道記錄模式對大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞 BKCa通道的生物物理特性進行了觀察。研究發現衰老可使其 BKCa通道的功能\\( 活性\\) 下降,主要表現為電壓敏感性和鈣敏感性下降、平均開放時間縮短和平均關閉時間延長。

另外,采用藥理學實驗發現,衰老大鼠腸系膜動脈平滑肌細胞 BKCa通道對 Tamoxifen 的敏感性下降。

Tamoxifen 是一種選擇性雌激素受體拮抗劑,其對BKCa通道的激活必須依賴于 β1亞基存在,因此具有檢測 β1亞基功能的作用。如上所述,β1亞基不僅可以明顯地增加 BKCa通道的電壓敏感性和鈣敏感性,也可以增加對 Tamoxifen、雌激素和 DHS-1 的敏感性。衰老伴隨的腸系膜動脈平滑肌細胞BKCa通道對 Tamoxifen 的敏感性減弱這一實驗現象提示,衰老很可能通過顯著降低β1亞基功能\\( 即α 亞基和 β1亞基非1∶1 下降\\) 使 BKCa通道的電壓敏感性和鈣敏感性下降,平均開放概率降低。

為驗證此推測,本研究中我們采用蛋白免疫印跡分析方法觀察了增齡對腸系膜動脈 BKCa通道 α亞基和 β1亞基蛋白表達的影響。在細胞水平,實驗發現 BKCa通道 α 亞基和 β1亞基表達均隨年齡增長逐漸減少,但 β1亞基下降得更為明顯。β1/ α 隨年齡增長而下降,青年組 > 中年組 > 老年組。此結果證實了我們的推測,即增齡可誘發腸系膜動脈 BKCa通道 α 和 β1亞基蛋白表達顯著下降,但 β1下降較α 亞基更為顯著; 此結果亦為 BKCa通道電生理功能學實驗提供了重要的分子依據。在增齡過程中,BKCa通道蛋白結構、功能、代謝等的變化可能是由于機體內在的或外在的因素通過某種機制如氧化作用、突變等引起的,這些機制改變了血管平滑肌對內源性血管活性物質及藥物的反應性,致使 BKCa通道的功能、活性和數目發生變化,導致了血管舒張功能的下降,最終成為心血管疾病發病的重要危險因素。

本研究未在 mRNA 水平上對增齡腸系膜動脈BKCa通道 α 和 β1亞基進行檢測,此為本實驗的不足之處。mRNA 水平和蛋白水平的改變以及兩者之間的關聯將能更全面地解釋增齡誘導大鼠腸系膜動脈 BKCa通道功能改變的機制,在今后的研究中我們將進一步深入探討。

4 結 論

增齡誘導大鼠腸系膜動脈 BKCa通道在血管張力維持中的貢獻下降,其分子機制可能為增齡誘發的 α 和 β1亞基表達非平行性下調,即 β1亞基下調較 α 亞基更為顯著。