動脈粥樣硬化\\( atherosclerosis,As\\) 是一個慢性炎癥性疾病。業以證明,血小板活化后可釋放大量的趨化因子,行使著除了止血以外的強大的炎癥和免疫調節作用,促進 As 的發展。血小板因子 4\\( platelet factor 4,PF4\\) 是血小板活化后釋放的最豐富的蛋白之一,不僅存在于 As 的早、晚期病變,且與病變分級、臨床癥狀等臨床參數相關,表明 PF4 在As 的發展中起重要作用。已有研究顯示 PF4 可誘導炎癥型巨噬細胞形成、單核細胞黏附于受損的內皮等炎癥過程。鑒于 PF4 與 As 臨床疾病嚴重程度的相關性,PF4 在 As 中的作用有待更深一步的研究。由血管炎癥引發的異常血管重塑在 As 發生發展中起主導作用?；|金屬蛋白酶 9\\( matrixmetalloproteinase-9,MMP-9\\) 作為炎性細胞因子在血管重構、斑塊不穩定性及其破裂中起著重要作用。在重構的血管,MMP-9 被大量的表達、分泌和活化。巨噬細胞、肥大細胞等炎性細胞是血管組織 MMP-9 的重要來源。而炎性因子如腫瘤壞死因子 α 和白細胞介素等可誘導 MMP-9 表達。但PF4 對 MMP-9 表達的影響還未見文獻報道。Toll 樣受體4\\( toll-like receptor 4,TLR4\\) 是天然免疫中介導細胞跨膜信號傳導的 Toll 樣受體家族成員。研究顯示在人 As 斑塊中 TLR4 的表達顯著提高; 活化的TLR4 可上調 MMP-9 表達、降解基質蛋白; 在大鼠模型中,TLR4 高表達可促進大鼠 As 斑塊的形成和血管重構。因此,本研究觀察 PF4 對巨噬細胞MMP-9 表達的影響及 TLR4 在其中的作用,旨在探討 PF4 對 As 斑塊穩定性的可能影響。

1、 材料與方法

1. 1 主要材料

重組人血小板因子 4\\( PF4\\) 購自 Peprotech 公司,脂多糖\\( LPS\\) 購自上海捷瑞公司,佛波脂\\( PMA\\)購自 Sigma 公司,胎牛血清購自杭州四季青生物研究所,RPMI1640 培養基購自美國 GIBCO 公司,TLR4 抗體型阻斷劑購自 Biolegend 公司,Trizol Re-agent 和引物分別從上海生物工程技術有限公司購買和合成,cDNA 第一鏈合成試劑盒購自 Fermentas公司,Taq PCR MasterMix 以及 DNA Marker 購自北京天根公司,MMP-9 一抗購自北京博奧森生物公司,TLR4 一抗購自 eBioscience 公司。THP-1 單核細胞系購自上海細胞庫。

1. 2 細胞培養

THP-1 單核細胞在含 10% 胎牛血清的 RP-MI1640 培養基中,靜置于 37℃ 、5% CO2培養箱中培養。實驗前,細胞用 160 nmol/L PMA 孵育 24 h,使其誘導成為巨噬細胞。換無血清的 RPMI1640 培養基培養 12 h,同步化后進行實驗。巨噬細胞分別經PBS\\( 溶劑對照\\) 、不同濃度 PF4\\( 25 ~ 200 μg / L\\) 、脂多糖\\( LPS,100 μg/L\\) 處理 4 h 或 12 h,RT-PCR 和Western blot 檢測 MMP-9 和 TLR4 表達; 為進一步研究 TLR4 在其中的作用,細胞經 TLR4 阻斷劑\\( 25μg\\) 預處理 30 min 后,再與 PF4 孵育特定時間,檢測MMP-9 表達。

1. 3 RT-PCR 反應

收集細胞,Trizol Reagent 試劑提取總 RNA。各樣本取 0. 2 μg 總 RNA 按 cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書進行逆轉錄。用 Taq PCR MasterMix 試劑進行 PCR 循環: 95℃ 溫育 5 min,95℃ 變性 45 s,54℃退火 45 s,72℃延伸 1 min,共 32 個循環,72℃,繼續延伸10 min。4℃冷卻。反應結束后,取反應產物進行 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,UVP 型凝膠圖象分析系統攝圖。TLR4、MMP-9 和 GAPDH 產物大小依次為 507 bp、476 bp 和 240 bp。以各組目的基因與 GAPDH 灰度值比值代表目的基因的 mR-NA 相對表達量。每組實驗重復 3 次。

1. 4 Western blot 分析

收集細胞,提取細胞總蛋白。取 50 μg 蛋白質加入 5 × SDS 凝膠上樣緩沖液,煮沸 100℃ 變性 5min。取變性蛋白質行 12% SDS-PAGE 電泳,并轉移至 PVDF 膜上。5% 脫脂牛奶室溫封閉,加入一抗TLR4 抗體、抗 MMP-9 抗體和抗 β-actin 抗體,4℃ 過夜。TBST 洗膜。加入辣根過氧化物酶標記的二抗,室溫孵育 2 h。發光劑激發熒光,顯影、定影后進行圖像分析。以目的蛋白和內參蛋白的灰度值比值,作為各組間蛋白相對表達量。每組實驗重復 3 次。

1. 5 統計學分析

所有數據均用x ± s 表示。用 SPSS 15. 0 統計分析軟件進行統計處理,兩組間比較用 Student’s t 檢驗,多重比較在 ANOVA 分析后用 Dunnett's-t 檢驗。P < 0. 05 為差異有顯著性意義。

2、結 果

2. 1 PF4 上調 THP-1 源性巨噬細胞 MMP-9 表達

THP-1 源性巨噬細胞未經處理時,細胞有 MMP-9 mRNA 表達。細胞經不同濃度 PF4 \\( 25 ~ 200 μg /L\\) 處理 4 h 后,RT-PCR 結果顯示\\( 圖 1\\) ,與對照組比,細胞 MMP-9 mRNA 水平隨著 PF4 濃度的增加而逐步升高。其中,最大效應濃度為 100 μg/L\\( P <0. 001\\) ,且高于 LPS 組的 MMP-9 mRNA 水平\\( P <0. 01; 表 1\\) 。與 MMP-9 mRNA 水平一致的是,經不同濃度\\( 25 ~200 μg/L\\) PF4 處理 12 h 后,THP-1 源性巨噬細胞 MMP-9 的蛋白水平也較對照組顯著上調,當 PF4 濃度為 100 μg/L 時,MMP-9 蛋白水平增高最為明顯\\( P <0. 01,圖 1 和表 1\\) 。

2. 2 PF4 上調 THP-1 源性巨噬細胞 TLR4 表達

對照組細胞有 TLR4 mRNA 表達。經不同濃度的 PF4 孵育后,與對照組比較,25 μg/L 和 50 μg/L的 PF4 對巨噬細胞 TLR4 的 mRNA 表達水平無明顯調節作用,然而 100 μg/L PF4 顯著上調 TLR4 的mRNA 表達水平\\( P < 0. 001\\) ,與 LPS 陽性對照組比較,TLR4 的 mRNA 表達水平顯著上調\\( P < 0. 05,圖 2 和表 2\\) 。PF4 濃度達 200 μg/L 時,TLR4 mR-NA 表達水平略有降低,但仍高于對照組。Westernblot 結果顯示,與對照組比較,100 μg / L PF4 顯著上調 TLR4 的蛋白表達水平\\( P < 0. 05; 圖 2 和表 2\\) ,與基因水平的檢測結果基本一致。

2. 3 TLR4 阻斷劑逆轉 PF4 上調巨噬細胞 MMP-9表達

為了探索 PF4 上調巨噬細胞 MMP-9 表達是否通過 TLR4 信號環節,實驗采用 TLR4 阻斷劑預處理細胞后,觀察 PF4 對巨噬細胞 MMP-9 表達的影響,RT-PCR 和 Western blot \\( 圖 3 \\) 結果均顯示,加入TLR4 阻斷劑后,其 MMP-9 mRNA 和蛋白表達水平均較 PF4 單獨孵育組顯著降低\\( P < 0. 05\\) 。同時,LPS 和 TLR4 阻斷劑共處理組的 MMP-9 mRNA 和蛋白表達水平也較 LPS 單獨孵育組低\\( P < 0. 05\\) ,表明 TLR4 是調節巨噬細胞 MMP-9 表達的重要環節\\( 表 3\\) 。

3、 討 論

血小板作為多功能細胞,不僅在止血過程中起作用,而且在炎癥、免疫和 As 等多種病理過程中起重要作用。新近的觀點認為,活化的血小板通過釋放多種活性因子影響 As 的發展。在眾多的活性因子當中,PF4 的含量最豐富,被認為是巨噬細胞成熟和血小板活化的標記物。值得注意的是,在 As性疾病患者血液中 PF4 水平較正常對照者顯著增高。但 PF4 在 As 的發生發展中起何種作用尚未闡明。

人 PF4 基因位于 4 號染色體長臂,全長 1000bp,含有 3 個外顯子,是小誘導基因\\( the small induc-ible gene,SIG\\) 家族中的一員。SIG 家族成員的基因組的外顯子結構極其相似,且其蛋白質的氨基酸序列有同源性,都含有 4 個保守的半胱氨酸殘基。

SIG 在凝血、感染、細胞生長方面扮演重要角色。大量研究表明,PF4 在血栓和動脈粥樣硬化斑塊形成中起重要作用。離體實驗發現,PF4 可誘導單核細胞存活、表達細胞因子、形成氧自由基和黏附于受損的內皮; 誘導炎性巨噬細胞\\( 無 CD163 表達\\) 形成; 抑制低密度脂蛋白受體\\( low density lipopro-tein receptor,LDLR\\) 降解、促進 LDL 氧化; 誘導氧化型低密度脂蛋白\\( ox-LDL\\) 與血管細胞和巨噬細胞結合等。動物實驗證實,敲除血小板 PF4 基因,可減少 ApoE- / -小鼠 As 病變面積。本實驗發現 PF4 可誘導巨噬細胞表達 MMP-9,且 TLR4 參與此過程。結果顯示,PF4 可以促進 THP-1 源性巨噬細胞 MMP-9 的表達。THP-1 源性巨噬細胞經不同濃度 PF4\\( 25 ~200 μg/L\\) 處理后,MMP-9 的 mR-NA 和蛋白水平均隨著 PF4 濃度的增加而逐步升高,尤其以濃度為 100 μg/L 時升高最為顯著。

基質金屬蛋白酶類\\( matrix metalloproteinases,MMP\\) 不僅是一種能分解細胞外基質的糖蛋白酶類,也是連接炎癥和血管重構的炎癥介質。研究證實動脈粥樣硬化斑塊纖維帽的厚度直接影響斑塊的穩定性,纖維帽越薄則斑塊越易破裂。纖維帽主要由膠原纖維與平滑肌細胞構成。MMP-9 是降解膠原的主要酶類之一,嚴重影響斑塊的穩定性。

實驗研究表明,腫瘤壞死因子 α 等多種炎性因子可誘導巨噬細胞、中性粒細胞等表達和分泌大量的MMP-9。而局部 MMP-9 含量增多不僅降解細胞外基質、促使平滑肌細胞從中膜遷移入內膜并增殖,還誘導炎癥細胞遷移、募集和黏附至血管壁,使血管壁細胞增殖或凋亡; 在 MMP-9 基因缺失的小鼠,As 斑塊內膠原含量增加,而巨噬細胞含量減少、斑塊面積縮小。臨床研究發現,急性腦梗死的患者外周血 MMP-9 的水平明顯升高,提示 MMP-9可能參與腦梗死的病理過程。新近研究發現,血清MMP-9 水平與人頸動脈總斑塊分數、斑塊不穩定性獨立相關。本實驗發現 PF4 促進巨噬細胞 MMP-9 表達上調,提示 PF4 可能通過促進 MMP-9 的表達,加劇血管炎癥反應及斑塊的不穩定性。

TLR 是固有免疫細胞膜上識別系統的重要組成部分。TLR4 是 TLR 家族成員,在內皮細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞及心肌細胞表達。

TLR4 可通過識別 LPS、熱休克蛋白 60 等,參與免疫調節和炎癥反應。我們的實驗結果顯示,PF4\\( 100 μg/L\\) 顯著上調 TLR4 的 mRNA 和蛋白表達水平。文獻報道 LPS 可激活 TLR4。本實驗以 LPS為陽性對照,結果顯示,與 100 μg/L LPS 比較,100μg/ L PF4 能上調巨噬細胞 MMP-9 和 TLR4 表達。

TLR4 阻斷劑是一種抗體型阻斷劑,本研究發現,TLR4 阻斷劑可逆轉 PF4 上調巨噬細胞 MMP-9 的表達,表明 TLR4 是 PF4 上調巨噬細胞 MMP-9 表達的重要信號環節。然而,50 μg/L PF4 處理組不能顯著改變 TLR4 mRNA 和蛋白表達水平,提示 PF4 上調 MMP-9 表達除了依賴 TLR4,可能還受其它的信號環節調節。文獻報道,TLR4 介導的信號轉導有MyD88 依賴性和非依賴性途徑。但調節 MMP-9表達的 PF4-TLR4 通路的下游是何種信號分子尚需進一步研究證實。

總之,本研究結果表明 PF4 經 TLR4 上調巨噬細胞 MMP-9 表達。PF4 可能通過上調 MMP-9 表達,促進 As 的發生發展。