腎素-血管緊張素系統\\( renin-angiotensin sys-tem,RAS\\) 的激活引起高血壓,血管緊張素Ⅱ\\( an-giotensin Ⅱ,AngⅡ\\) 作為該系統的最終效應分子,可上調人臍動脈平滑肌細胞\\( human umbilical arterysmooth muscle cells,HUASMC\\) 缺氧誘導因子 1\\( hy-poxia-inducible factor-1,HIF-1α\\) 的表達,增加其下游血管內皮生長因子 \\( vascular endothelial growthfactor,VEGF\\) 表達,具有促 HUASMC 增殖[1]的作用,是導致高血壓血管阻力增加的原因之一.HIF-1α 是缺氧調節中的重要因子,其表達主要受氧濃度影響,低氧可在轉錄和翻譯水平激活 HIF-1α 的表達,對其下游基因進行調節,產生一系列代償或病理反應,在氧穩態調節、低氧適應等方面發揮重要作用.此外,AngⅡ、凝血酶等非缺氧刺激也能上調HIF-1α 的表達[2].AngⅡ可通過不同機制在轉錄或翻譯水平影響 HIF-1α 的表達[3],也可在翻譯后水平影響細胞 HIF-1α 的穩態,如: 在翻譯后水平影響HIF-1α 的羥化.脯氨酸羥化酶\\( prolyl hydroxylases,PHD\\) 和缺氧誘導因子 1 抑制因子\\( factor inhibitinghypoxia-inducible factor-1,FIH-1\\) 是羥化 HIF-1α 的關鍵酶.哺乳動物有 3 種 PHD: 即 PHD1、PHD2 和PHD3,其相對活性大小為 PHD2 > PHD3 > PHD1,PHD2 對 HIF-1α 的調節呈氧依賴性,是常氧狀態下維持 HIF-1α 穩態水平的關鍵限制酶[4].常氧時PHD2 與 FIH-1 羥化 HIF-1α,使之迅速降解; 缺氧時,PHD2 失去活性、FIH-1 酶活性受抑制,HIF-1α降解受阻,在胞內積聚并轉位入核,促進其下游低氧反應基因的轉錄,引起細胞對低氧的一系列反應.Pagé 等[5]研究表明,在 HUASMC 中,AngⅡ通過調節細胞內抗壞血酸濃度改變 PHD2 的活性,在翻譯后水平改變 HIF-1α 的羥化,影響胞內 HIF-1α的穩定性,PHD2 基因與蛋白的表達不受 AngⅡ的影響.AngⅡ對 HUASMC 中 FIH-1 的影響及其具體機制如何尚未見報道.本研究擬通過觀察 AngⅡ對HUASMC 中 HIF-1α、VEGF 以及 PHD2、FIH-1 和 p-ERK 表達的影響,探討 PHD2、FIH-1、p-ERK 在 AngⅡ影響 HIF-1α 表達中的作用; 并用 ERK 信號通路抑制劑 PD98059 阻斷 ERK 信號通路激活,探討ERK 通路在 Ang Ⅱ作用下介導 FIH-1 影響 HIF-1α的可能機制.
1 材料和方法
1. 1 主要材料
HUASMC 購于美國 Scien Cell 公司; AngⅡ購于美國 Sigma 公司; 細胞培養基、胎牛血清、胰蛋白消化酶、RIPA 裂解液購于瑞典 Gibco 公司; 青霉素和鏈霉素購于美國 Sigma 公司; 兔抗 HIF-1α、兔抗PHD2 購于瑞典 Novus Bioscience 公司; 兔抗 VEGF、兔抗 FIH-1 購于英國 Abingdon 公司; HRP 標記的二抗購于瑞典 Amersham Biosciences 公司; PVDF 膜購于美國 Millipore 公司; ECL 顯色試劑盒購于 GEHealthcare 公司.
1. 2 HUASMC 的復蘇、傳代培養及分組
將細胞凍存管從液氮中取出,迅速復溫到 37℃,將細胞懸液吸入 15 mL 離心管,1000 r/min 離心 5min,棄上清,以含 20% 胎牛血清的細胞培養基 15 mL吹打,制成細胞懸液,用5 mL 移液器轉移細胞懸液至一次性細胞培養瓶中,放入 37℃、5% 的 CO2培養箱中培養.待細胞生長融合 80% 時,吸出培養液,PBS輕輕洗蕩 3 次,加入胰蛋白消化酶 l mL 消化 2 ~ 3min 棄胰酶,加入含 10% 胎牛血清的細胞培養基終止消化,用5 mL 移液器吹打,使細胞完全脫落,并吹打混勻.取0.1 mL 消化液,倒置顯微鏡下觀察計數,調整細胞數為5 ×10^8/ L,將細胞懸液接種于新的培養瓶中,每24 h 換液一次.細胞分為 3 組: \\( 1\\) 對照組: 正常培養基培養細胞6 h; \\( 2\\) AngⅡ組:含 AngⅡ的培養基\\( 終濃度為 10^- 6mol / L\\) 培養細胞 6 h; \\( 3\\) AngⅡ +PD98059 組: 含 PD98059 的培養基 \\( 終濃度為 10^- 5mol / L\\) 預處理細胞 1 h 后,加入含 AngⅡ的培養基\\( 終濃度為10^- 6mol / L\\) 培養細胞 6 h.
1. 3 Real Time PCR 檢測 HIF-1α、VEGF、PHD2 和FIH-1 基因表達Trizol 法提取細胞 RNA,逆轉錄成 cDNA,以 β-actin 為內參行 Real Time PCR,記錄 Ct 值,分別檢測HIF-1α、VEGF 以及 PHD2、FIH-1 的基因表達.HIF-1α 上、下游引物分別為 5'-TGC TTG GTG CTG ATTTGT GA-3'和 5'-GGT CAG ATG ATC AGA GTC CA-3',產物長度 209 bp.VEGF 上、下游引物分別為 5'-CCT CCG AAA CCA TGA ACT TT-3'和 5'-AGA GATCTG GTT CCC GAA AC-3',產物長度 637 bp.PHD2上、下游引物分別為 5'-CTC ACT GAC CTA CGCCGT GT-3' 和 5'-CGC ATC TTC CAT CTC CAT TT-3'.FIH-1 上、下游引物分別為 5'-ACA GTG CCAGCA CCC ACA AC-3'和 5'-GCC CAC AGT GTC ATTGAG CG-3'.PCR 條件為: 95℃ 變性 5 min,94℃ 20s,72℃ 20 s,72℃ 5 min,55℃ 10 s,40 個循環.內參β-actin 上、下游引物分別為 5'-GTG GGG CGC CCCAGG CAC CA-3'和 5'-CTT CCT TAA TGT CAC CCACGA TTT C-3',產物長度 540 bp,其 PCR 條件為:94℃ 變性 5 min,94℃ 30 s,66℃ 45 s,72℃ 45 s,72℃ 10 min,40 個循環.
1. 4 Western blot 檢測 HIF-1α、VEGF、PHD2、FIH-1、ERK 和 p-ERK 的蛋白表達.分組處理細胞后,棄培養基,PBS 洗2 次,加 RIPA裂解液,冰孵30 min,4℃ 12000 r/min 離心20 min,收取上清液分裝于 -80℃備用.取總蛋白 60 μg,100℃煮沸 5 min,10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,轉印到 PVDF 膜,5%脫脂牛奶封閉60 min,加一抗\\( 稀釋度1∶1000\\) ,4℃過夜,HRP 標記的二抗孵育1 h,TBS-T漂洗5 次\\( 每次5 min\\) .ECL 試劑盒顯影,X 線片掃描后,Image J 圖像分析軟件分析.
1. 5 統計學分析
數據用x ±s 表示,SPSS 17.0 軟件進行統計分析.多組間比較用 ANOVA 方差分析,組間比較用獨立樣本 t 檢驗; 雙側 P <0.05 表示差異有統計學意義.
2 結 果
2. 1 HIF-1α、VEGF、PHD2 和 FIH-1 基因的表達
與對照組比較,AngⅡ組 HIF-1α、VEGF 基因表達顯著增加,FIH-1 基因表達降低\\( P 均 < 0. 05\\) ,PHD2 基因表達無顯著變化.與 AngⅡ組比較,AngⅡ + PD98059 組 HIF-1α、VEGF 基因表達顯著降低,FIH-1 基因表達增加\\( P 均 < 0. 05 \\) ,同樣 PHD2 基因表達無明顯改變\\( 圖 1\\) .
2. 2 HIF-1α、VEGF、PHD2、FIH-1 及 ERK、p-ERK 蛋白的表達
與對照組比較,AngⅡ組 HIF-1ɑ、VEGF 蛋白表達顯著增加,FIH-1 蛋白表達顯著降低\\( P 均 <0. 05\\) ,而 PHD2 蛋白和 ERK 蛋白表達無顯著變化,但磷酸化 ERK \\( p-ERK\\) 蛋白表達顯著增加\\( P <0. 05\\) .與AngⅡ組比較,AngⅡ+ PD98059 組 HIF-1ɑ、VEGF 蛋白表達顯著降低,FIH-1 蛋白表達顯著增加\\( P 均 <0. 05\\) ,而 PHD2 蛋白和 ERK 蛋白表達無明顯改變,p-ERK 蛋白表達顯著降低\\( P < 0. 05; 圖 2\\) .
3 討 論
高血壓時 AngⅡ與其受體 AT1R 結合后通過多條信號通路促進平滑肌細胞增殖、向內膜遷移,是導致血管阻力增大的原因之一.AngⅡ上調 HIF-1α的表達后促進 HIF-1α 下游靶基因 VEGF 的表達,在平滑肌細胞增殖中起重要作用.與以往研究一致[1,6],我們的結果顯示,AngⅡ處理的 HUASMC 中HIF-1α 和 VEGF 的表達均顯著增加,說明 AngⅡ上調 HIF-1α 表達,具有促 VEGF 表達的作用.
HIF-1α 是細胞缺氧時被誘導產生的關鍵因子,通過激活其下游近 100 多種與缺氧相關基因的轉錄,在缺氧適應性反應和損傷中起重要作用.HIF-1α 翻譯后水平的調節受氧濃度影響: 常氧時,HIF-1α 被氧依賴性與氧非依賴性通路所激活的酶降解,幾乎無活性; 細胞缺氧時,堆積在胞漿的 HIF-1α 入核,與靶基因 DNA 結合,發揮其轉錄激活功能.
PHD2 是翻譯后水平調節 HIF-1α 的限速酶,通過羥化 HIF-1α 促進其降解[7].我們發現,AngⅡ組HIF-1α 表達雖增加,但 PHD2 基因和蛋白表達無顯著變化.根據 Pagé 等[5]研究結果,需考慮 AngⅡ不影響 PHD2 基因和蛋白表達,但不排除其它因素參與 AngⅡ對 HIF-1α 的調節作用.
FIH-1 是另一種在翻譯后水平通過羥化 HIF-1α而影響其穩態的關鍵酶.FIH-1 的蛋白表達在組織細胞中比較穩定[8],對低氧的耐受性比 PHD2 強,0. 2% 的低氧處理可使 PHD2 的羥化作用失活,但FIH-1 的羥化作用仍存在[9],缺氧不改變 FIH-1 蛋白的表達[10].有研究表明 FIH-1 的轉錄活性受PKC 信號通路的影響,活化的 PKC 通過與 FIH-1 基因 DNA 的 CDP/Cut 相結合,可抑制 FIH-1 的轉錄活性[11].結果顯示,AngⅡ顯著降低 HUASMC 中 FIH-1 基因和蛋白表達的同時,顯著激活 ERK 信號通路,增加 p-ERK 蛋白表達; 用 ERK 抑制劑 PD98059阻斷 ERK 信號通路的活化后,p-ERK 蛋白表達顯著降低,FIH-1 表達上調,HIF-1α、VEGF 表達均下降.
提示 ERK 通路對 FIH-1 的影響趨勢與 PKC 通路的影響趨勢類似: ERK 信號通路激活后磷酸化的 ERK介導 AngⅡ下調 FIH-1 的表達,使 HIF-1α 的降解減少,增加細胞內 HIF-1α 蛋白表達以及 VEGF 基因和蛋白表達,這可能是 AngⅡ上調 HIF-1α 蛋白表達的機制; 然而 ERK 信號通路介導 AngⅡ下調 FIH-1 表達的具體作用機制有待進一步研究.同時,HUA-SMC 中 HIF-1α 基因表達上調并不能單一地歸于FIH-1 表達下降所致,可能 AngⅡ本身從轉錄水平上調了 HIF-1α 的基因表達[3].
綜上所述,我們發現磷酸化 ERK 信號通路介導AngⅡ下調 HUASMC 中 FIH-1 基因和蛋白表達,該表達的下調可能是 AngⅡ上調 HIF-1α 蛋白表達的機制之一; ERK 抑制劑削弱了 AngⅡ對 HUASMC 中 HIF-1α、VEGF 表達的誘導作用.這些結果為防治高血壓AngⅡ促血管平滑肌細胞增殖提供了新思路.
[參考文獻]
[1]Richard DE,Berra E,Pouyssegur J. Nonhypoxic pathway mediatesthe induction of hypoxia-inducible factor 1alpha in vascular smoothmuscle cells[J]. J Biol Chem,2000,275 \\( 35\\) : 26 765-771.
[2]G\ue56erlach A,Diebold I,Schini-Kerth VB,et al. Thrombin activatesthe hypoxia-inducible factor-1 signaling pathway in vascular smoothmuscle cells: role of the p22 \\( phox\\) -containing NADPH oxidase[J]. Circ Res,2001,89 \\( 1\\) : 47-54.
[3]Pagé EL,Robitaille GA,Pouysségur J,et al. Induction of hypoxia-inducible factor-1 by transcriptional and translational mechanisms[J]. J Biol Chem,2002,277 \\( 50\\) : 48 403-409.
[4]Su Y,Loos M,Giese N,et al. Prolylhydroxylase-2 \\( PHD2\\) exertstumor-suppressive activity in pancreatic cancer[J]. Cancer,2012,118 \\( 4\\) : 960-972.
[5]Pagé EL,Chan DA,Giaccia AJ,et al. Hypoxia-inducible factor-1alpha stabilization in nonhypoxic conditions: role of oxidation andintracellular ascorbate depletion[J]. Mol Biol Cell,2008,19 \\( 1\\) :86-94.
[6]Lauzier MC,Pagé EL,Michaud MD,et al. Differential regulationof hypoxia-inducible factor-1 through receptor tyrosine kinase trans-activation in vascular smooth muscle cells [J]. Endocrinology,2007,148 \\( 8\\) : 4 023-031.
[7]McMahon S,Charbonneau M,Grandmont S,et al. Transforminggrowth factor beta1 induces hypoxia-inducible factor-1 stabilizationthrough selective inhibition of PHD2 expression[J]. J Biol Chem,2006,281 \\( 34\\) : 24 171-181.
[8]Bracken CP,Fedele AO,Linke S,et al. Cell-specific regulation ofhypoxia-inducible factor \\( HIF\\) -1alpha and HIF-2alpha stabilizationand transactivation in a graded oxygen environment[J]. J BiolChem,2006,281 \\( 32\\) : 22 575-585.
[9]Stolze IP,Tian YM,Appelhoff RJ,et al. Genetic analysis of therole of the asparaginyl hydroxylase factor inhibiting hypoxia-induc-ible factor \\( HIF\\) in regulating HIF transcriptional target genes[J].J Biol Chem,2004,279\\( 41\\) : 42 719-725.
[10]Fukuba H,Yamashita H,Nagano Y,et al. Siah-1 facilitates ubiq-uitination and degradation of factor inhibiting HIF-1alpha \\( FIH \\)[J]. Biochem Biophys Res Commun,2007,353\\( 2\\) : 324-329.
[11]Li J,Wang E,Dutta S,et al. Protein kinase C-mediated modula-tion of FIH-1 expression by the homeodomain protein CDP / Cut /Cux[J]. Mol Cell Biol,2007,27 \\( 20\\) : 7 345-353.
